[发明专利]Arvcf基因敲除动物模型的构建方法及应用

权利要求书

1.一种Arvcf基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，包括：

根据小鼠Arvcf基因结构的信息，确定待敲除的区域为外显子4-10，在敲除区域的上游和下游分别设计两条sgRNA和对应的引物，所述的敲除区域上游的sgRNA和反向引物的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述的敲除区域下游的sgRNA和反向引物的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

使用所述的sgRNA和引物，通过线性化载体、寡核苷酸链的退火、连接、重组质粒的转化，构建sgRNA/Cas9表达载体；

将所述的sgRNA/Cas9表达载体线性化并纯化后，作为模板进行体外转录，合成sgRNA和Cas9 mRNA；

将合成的sgRNA和Cas9 mRNA一同注射进入小鼠的受精卵中，再将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，出生的F0代小鼠包含Arvcf基因敲除的杂合子小鼠，然后通过PCR反应和测序鉴定为阳性杂合子小鼠时，该小鼠即可稳定遗传；

取被鉴定为阳性杂合子小鼠进行杂交繁育，获得Arvcf敲除的纯合子个体和野生型个体。

2.根据权利要求1所述的一种Arvcf基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，使用在线的CRISPR Design工具在敲除区域的上游和下游分别设计sgRNA和对应的引物。

3.根据权利要求1所述的一种Arvcf基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，所述的PCR反应中的两对引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。

4.根据权利要求3所述的一种Arvcf基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，使用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6这一对引物以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8另一对引物分别进行PCR反应，通过PCR产物条带在凝胶电泳中的大小及有无判断所获得小鼠基因型为野生型、杂合子或者纯合子，并且所获得的Arvcf敲除小鼠的第4-10个外显子被完全敲除，碱基有3bp和5805bp的缺失。

5.根据权利要求1-4任一所述的一种Arvcf基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，所述的动物模型构建方法是基于CRISPR/Cas9技术进行小鼠Arvcf基因敲除的。

6.根据权利要求5所述的构建方法构建的Arvcf基因敲除动物模型的应用，其特征在于，作为研究ARVCF在所参与的精神类疾病中的作用的动物模型。