[发明专利]一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用

权利要求书

1.一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述基因工程菌株通过对自身可产生麦角硫因的新金色分枝杆菌进行代谢工程改造而成，包括过表达egtABCDE基因簇，敲除菌株内源的Mn_hal基因，以及共表达Mn_hisC和Mn_allB1基因，所述新金色分枝杆菌的保藏号为ATCC 25795，所述基因工程菌株的构建方法包括以下步骤：

A：将自杀质粒p19-Mn_hal电转化导入Mn-egtABCDE-hisG菌株感受态，涂布卡那霉素和潮霉素双抗性平板长出单克隆，利用同源臂引物D-Mn_hal-UFD-Mn_hal-DR进行PCR扩增筛选，选择条带大小为1996bp的单克隆菌株，即为MnΔhal-egtABCDE-hisG菌株；以及

B：将整合型质粒pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1电转化导入MnΔhal-egtABCDE-hisG感受态，涂布卡那霉素和潮霉素双抗性平板长出单克隆，利用E-Mn_hisC-Mn_allB1-FE-Mn_hisC-Mn_allB1-R进行PCR扩增验证，如能扩增出1000bp左右的阳性条带，所对应的菌株为MnΔhal-attB::(hisC-allB1)-egtABCDE-hisG菌株，即为一种可用于生产麦角硫因的基因工程菌株；

所述自杀质粒p19-Mn_hal的构建包括以下步骤：

A1：以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用同源臂引物D-Mn_hal-UFD-Mn_hal-UR，D-Mn_hal-DFD-Mn_hal-DR分别扩增上、下游同源臂序列，获得上、下游同源臂纯化产物；

A2：p2NIL质粒提取物采用HindIII和BamHI进行酶切，上游同源臂纯化产物利用HindIII和EcoRI进行酶切，下游同源臂纯化产物利用EcoRI和BamHI进行酶切，T4酶连接，获得重组质粒p2NIL-Mn_hal；

A3：将pGOAL19质粒产物、重组质粒p2NIL-Mn_hal分别用PacI酶切，T4酶连接，转入大肠杆菌DH5α感受态，扩大培养、抽提获得自杀质粒p19-Mn_hal的纯化产物，电转，涂布蔗糖致死平板，筛选正确的双交换突变菌株，即可获得自杀质粒p19-Mn_hal；

Mn_hal基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；

所述同源臂引物D-Mn_hal-UFD-Mn_hal-UR，D-Mn_hal-DFD-Mn_hal-DR的核苷酸序列如SEQ ID No:2-5所示；

所述整合型质粒pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1的构建包括以下步骤：

B1：Mn_hisC基因拷贝数增加菌株的构建：

1)以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用引物E-Mn_hisC-FE-Mn_hisC-R扩增获得Mn_hisC的基因序列；

2)将pMV261质粒产物、Mn_hisC的基因序列，用BamHIEcoRI酶切纯化回收，T4酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，获得重组质粒pMV261-Mn_hisC；

B2：Mn_hisC-Mn_allB1共强化菌株的构建：

1)以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用引物E-Mn_hisC-Mn_allB1-FE-Mn_hisC-Mn_allB1-R扩增获得Mn_allB1的基因序列片段；

2)重组质粒pMV261-Mn_hisC质粒采用HpaI酶切，纯化回收得到质粒骨架，与Mn_allB1的基因序列片段进行无缝克隆连接，获得重组质粒连接产物pMV261-hisC-allB1；

3)将连接产物pMV261-hisC-allB1转化大肠杆菌DH5α，涂布卡那霉素抗性平板进行克隆筛选，经菌落PCR、质粒酶切和质粒测序验证，即可获得重组质粒pMV261-Mn_hisC-Mn_allB1；

4)利用XbaIHpaI酶切重组质粒pMV261-Mn_hisC-Mn_allB1，将pMV306的质粒产物，采用XbaIHpaI进行酶切，T4连接酶连接，随后转化大肠杆菌DH5α感受态，使用潮霉素抗性平板筛选单克隆，获得pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1；

Mn_hisC基因的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示，Mn_allB1基因的核苷酸序列如SEQ IDNo:7所示；

引物E-Mn_hisC-FE-Mn_hisC-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No:8和SEQ ID No:9所示，引物E-Mn_hisC-Mn_allB1-FE-Mn_hisC-Mn_allB1-R的核苷酸序列分别如SEQ IDNo:10和SEQ ID No:11所示。