[发明专利]一种鸡PTF1a基因重组蛋白、多克隆抗体制备方法

说明书

本发明属于多克隆抗体制备技术领域，具体涉及分子克隆、抗体制备技术领域，具体涉及一种鸡PTF1a基因重组蛋白、多克隆抗体的制备及纯化方法。本发明根据Genbank中Ptf1a基因设计具有高效扩增能力的特异性扩增Ptf1a基因的引物，制备出大小正确、纯度在85%左右的重组抗原蛋白，免疫日本大耳兔获得高效价抗血清，纯化得到浓度为10mg/ml，纯度为90%的特异性多克隆抗体，经WB检测与重组抗原在47kDa处有特异性识别，且条带单一，可以作为抗体用于WB检测鸡Ptf1a蛋白水平，为评估鸡胰腺外分泌发育情况，为鸡育种及功能性酶制剂添加提供参考。

技术领域

本发明属于分子克隆、抗体制备技术领域，具体涉及一种鸡PTF1a（Pancreasassociated transcription factor 1a）基因重组蛋白、多克隆抗体的制备及纯化方法。

背景技术

腺泡细胞来源于胰腺干细胞PTF1a的表达，PTF1a是bHLH转录因子，最初在胰腺祖细胞中表达，之后存在于腺泡中。缺乏PTF1a会导致腺泡细胞形成受阻，PTF1a基因突变小鼠的分析显示，PTF1a mRNA存在剂量阈值，该阈值使得胰腺的分化结果沿着指定的途径发育。PTF1a mRNA剂量的减少导致早期胰腺前体细胞增殖减少，外分泌细胞分化受损。

在斑马鱼中的研究表明，减少PTF1a表达会导致多能祖细胞分化形成内分泌部，而增加PTF1a表达使胰腺祖细胞分化形成腺泡的概率增加。因此，PTF1a可能具有双重作用，取决于其表达水平或活性。尽管在胰腺胚胎发育过程中积累了有关PTF1a功能和剂量的信息，但有关PTF1a在成熟胰腺中作用的认知仍然有限。PTF1a最初被发现是成熟腺泡细胞中淀粉酶和弹性蛋白酶等消化酶的转录调节因子。Krah等人研究表明成熟腺泡细胞中PTF1a的条件缺失导致导管化生，并使细胞对Kras转化高度敏感。最近的研究表明PTF1a在成熟腺泡中表达，诱导细胞周期抑制剂Cdkn1a（p21）的表达。因此，PTF1a的表达可能有助于改善成熟腺泡细胞的低增殖指数。但在家禽中，PTF1a基因鲜有报道。

因此，Ptf1a是评估胰腺腺泡细胞功能成熟的重要标志物，对家禽育种及饲料添加剂应用具有指导意义。转录因子Ptf1a在体内以蛋白质分子的形式影响胰腺外分泌发育和功能成熟，研究表明Ptf1a基因受miRNA转录后调控影响，应用RT-PCR法检测Ptf1a基因mRNA转录水平与组织中蛋白水平无相关性，需要使用抗体来检测其蛋白含量。当前市售Ptf1a抗体多为人，小鼠，大鼠等动物，且与鸡同源性较差无法使用。因此急需鸡源Ptf1a抗体来测定组织中转录因子水平，从而应用评估鸡胰腺外分泌发育情况，为鸡育种及功能性酶制剂添加提供参考。

发明内容

针对目前在家禽研究领域中未有PTF1a基因相关研究的缺陷和问题，本发明提供一种鸡PTF1a基因重组蛋白、多克隆抗体的制备及纯化方法。

本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种用于扩增鸡PTF1a基因的引物组，碱基序列如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.22所示。

本发明还提供一种鸡PTF1a基因重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.24。

本发明还提供一种鸡PTF1a基因多克隆抗体制备方法，包括以下步骤：

步骤一、设计引物进行PCR扩增，以PET-B2M为载体，以NotI CpoI酶切位点进行载体与鸡PTF1a基因的连接得到重组质粒，并转化至感受态细胞中，将转化后的感受态细胞进行培养，选取阳性克隆抗体进行测序；

步骤二、将测序正确的阳性克隆接种于LB中扩大培养，挑选含重组质粒的单菌落进行培养，超声破碎菌体，离心收集上清和沉淀，获得包涵体蛋白；

步骤三、将将包涵体蛋白溶解、亲和纯化，测定重组蛋白纯度；

步骤四、将重组蛋白进行三次动物免疫，末次免疫后10d采集动物血清抗原，对抗原进行效价检测、抗体纯化并对抗原进行WB检测。