[发明专利]利用线粒体基因编辑系统培育植物雄性不育系的方法

说明书

本发明公开了一种利用线粒体基因编辑系统培育植物雄性不育系的方法，属于植物基因工程育种领域。本发明的方法主要依靠一种特别设计的质粒，所述质粒包括如下2个表达框：(1)表达Cas9蛋白的表达框，由启动子、靶向线粒体的信号肽基因、Cas9基因和终止子组成；(2)表达sgRNA的表达框，由启动子、靶点序列和gRNA序列组成；所述靶点序列是与靶基因同源的长度16～24bp的序列。当靶基因为植物atp9基因时，可通过转染该质粒培育植物雄性不育系，其中包括雄蕊瓣化不育系。

技术领域

本发明属于植物基因工程育种领域。

背景技术

植物雄性不育系，是雄蕊发育不正常但雌蕊发育正常的植物品系，不能产生正常功能的花粉，但能接受正常花粉而结实。

植物不育系在植物育种，尤其是农作物育种中具有重要地位。其可降低杂交种子生产成本，提高杂种质量，扩大杂种优势的利用范围。著名的三系杂交水稻就使用了胞质雄性不育系。

雄性不育系中有一种特殊表型称为雄蕊瓣化表型，在园艺领域具有较为重要的地位。雄蕊瓣化是雄蕊发育成花瓣的现象，该现象能使花卉产生重瓣(重瓣牡丹、重瓣百合均在此列)，增加观赏性。

胞质雄性不育系，即细胞质的基因引起的雄性不育，通常为线粒体内基因突变引起的雄性不育。植物atp9基因是线粒体基因，使用RNAi敲低atp9可形成无雄蕊的胞质雄性不育植株(陶瑶.orf25和atp9基因干扰对烟草雄性不育性的影响[D].江西农业大学.2017)。但RNAi敲低产生的表型不能随着传代稳定维持下来，在育种工作中的应用意义不大。

近年来发展起来的基因组编辑技术，因其在DNA特异位点引入突变，且表型能较稳定地遗传，成为功能基因组研究和精准育种的有力工具。基因组编辑技术的原理是利用可修饰的核酸内切酶在基因组特异位点引入DNA双链断裂，并利用细胞的修复机制实现目的基因组区域的DNA序列改变。

第一代和第二代基因编辑系统分别为ZFNs系统和TALENs系统，都是依赖经过设计的、序列特异性的DNA结合元件和非特异性的DNA切割结构域组成的核酸酶分子，对特定序列进行切割。这两种基因编辑系统由于需要复杂的序列特异性的DNA结合元件，并获得特异性的融合蛋白，流程较为复杂，成本较高。

第三代基因编辑系统为CRISPR/Cas系统(以CRISPR/Cas9系统为代表)，其依赖gRNA与Cas酶形成复合体，对靶基因进行编辑，设计更为简单，成本更低，而且编辑效率高，是目前最为流行的基因编辑系统。

尽管与ZFNs和TALENs系统相比具有较强的优势，CRISPR/Cas系统却很难对植物线粒体进行基因编辑。

基于上述原因，目前尚未见使用CRISPR/Cas系统对植物线粒体基因进行编辑的技术，更未见使用CRISPR/Cas系统构建胞质雄性不育系的研究，对植物线粒体的基因编辑技术主流仍是复杂的TALENs系统。

发明内容

本发明要解决的问题是：

1)提供一种利用CRISPR/Cas系统编辑植物线粒体基因的方法；

2)提供一种利用该原理培育胞质雄性不育系的方法；

3)提供一种利用CRISPR/Cas系统培育雄蕊瓣化不育系的方法。

本发明的技术方案如下：

一种用于植物线粒体基因编辑的质粒，所述质粒包括如下2个表达框：

(1)表达Cas9蛋白的表达框，由启动子、靶向线粒体的信号肽基因、Cas9基因和终止子组成；

(2)表达sgRNA的表达框，由启动子、靶点序列和gRNA序列组成；