[发明专利]一种利用重组微生物全细胞催化合成L-苯乳酸的方法

说明书

本发明公开了一种利用重组微生物全细胞催化合成L‑苯乳酸的方法，属于酶工程和基因工程技术领域。本发明提出了一种有效的多酶串联重组大肠杆菌全细胞催化苯丙氨酸合成L‑苯乳酸的转化体系，首次将L‑氨基酸脱氨酶和苯丙酮酸还原酶用于催化苯丙氨酸合成L‑苯乳酸，成功实现了L‑氨基酸脱氨酶，苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达菌株的构建。最终产量达到21.39g/L，摩尔转化率为71.33％。采用全细胞催化合成苯乳酸，操作工艺便捷，转化效率优于以往L‑苯乳酸的生物合成方法，为L‑苯乳酸工业化生产及应用奠定了理论和实践基础，具有一定指导意义。

技术领域

本发明涉及一种利用重组微生物全细胞催化合成L-苯乳酸的方法，属于酶工程和基因工程技术领域。

背景技术

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，即2-羟基-3-苯基丙酸，是一种小分子天然有机酸，广泛存在于干酪、天然蜂蜜中。作为一种天然抑菌物质，对多种病原性微生物都具有光谱抑制作用，但对人和动物细胞均无毒性。其溶解性良好，可均匀溶解于水性溶剂中。此外，苯乳酸具有耐酸、耐碱、耐高温等特性，并能有效的抑制食腐性微生物的生长，在食品工业中具有广阔的应用前景。

L-苯乳酸作为苯乳酸两种对映异构体中的一种，是合成许多药物制剂的前体，此外，作为一种重要化工合成的原材料，可以用于合成非蛋白氨基酸、抗HIV试剂和降血糖剂等。

目前国内外合成L-苯乳酸主要是化学合成法、微生物发酵和生物催化合成。化学合成法技术路线复杂，反应条件苛刻，使用大量有机溶剂易于产生环境污染，副产物多，后续分离困难，不易纯化。微生物发酵法主要指利用筛选或改造的具有特殊性能的菌体，在合适的发酵条件下，通过微生物分解代谢与合成代谢生产出苯乳酸。目前报道以苯丙酮酸为底物合成苯乳酸的文献较多，关于苯丙氨酸一步合成苯乳酸的报道较少，且苯丙酮酸价格偏高，挖掘能够成本低廉并高效转化的生物催化合成苯乳酸方法是未来研究亟待解决的问题。

目前，以苯丙氨酸为底物转化合成苯乳酸，并实现辅因子NAD⁺和NADH的循环，至少需要三个酶的参与，比如用氨基酸脱氨酶和乳酸脱氢酶转化苯丙氨酸合成苯乳酸，还需在体系中添加葡萄糖脱氢酶，再在乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的作用下实现辅因子NAD⁺和NADH的循环，但是，此种方法的成本过高。

全细胞转化相比分离酶具有如下优势：全细胞生物催化剂更容易制备，成本低；比分离酶更稳定，不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物。有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化苯乳酸生产。

因此，提供构建一种操作简便、成本低、转化率高、适合工业化生产的多酶级联催化反应体系，实现苯丙氨酸到L-苯乳酸的一步反应，对于工业上制备L-苯乳酸有重要的应用价值。

发明内容

技术问题：

本发明要解决的技术问题是：提供一种能够转化苯丙氨酸生成L-苯乳酸的基因工程菌，并且构建一种操作简便、成本低、转化率高、适合工业化生产的多酶级联催化反应体系，实现苯丙氨酸到L-苯乳酸的一步反应，以解决工业化苯乳酸生产高成本、底得率、污染严重的问题。

技术方案：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种以苯丙氨酸为底物生产L-苯乳酸的基因工程菌，该基因工程菌共表达L-氨基酸脱氨酶、苯丙酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶。

在本发明的一种实施方式中，以细菌或真菌为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，以pET-28a为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶来源于普通变形杆菌Proteusvulgaris。

在本发明的一种实施方式中，所述苯丙酮酸还原酶来源于乳酸杆菌Lactobacillus sp.CGMCC 9967。