[发明专利]基于基因编辑技术的双信号输出检测转基因大豆的电化学传感器的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种基于基因编辑技术的双信号输出检测转基因大豆的电化学传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)磁性材料Fe₃O₄@AuNPs合成

(2)信号单元合成

将180～220μL Fe₃O₄@AuNPs转移到培养瓶中后，加入15～20μL 3～5mmol/L钌配合物[Ru(bpy)₂]²⁺和150～200μL 90～100μg/mL DNA-Fc，并将pH值调整为7.5，在35℃下孵育4～6小时后，添加160～200μL 2wt％牛血清蛋白溶液以阻断非特异性结合位点，再用磁清洗的方法除去游离的DNA-Fc后重新分散到200μL水中，即得信号单元Fe₃O₄@AuNPsDNA-Fc/[Ru(bpy)₂]²⁺；

(3)CRISPR/Cas12非特异性切割过程

将2～5μL 1～3pmol/L的Cas12a酶溶液和2～5μL 5～10pmol/L的crRNA溶液混匀，室温孵育5～10分钟，加入2～5μL 10μmol/L的t-DNA溶液和10～20μL 10×结合缓冲液混匀，室温孵育10～15分钟，之后再加入5～10μL信号单元Fe₃O₄@AuNPsDNA-Fc/[Ru(bpy)₂]²⁺溶液，37℃孵育45～90分钟后，采用磁分离的方法吸取磁性材料部分，将磁性材料部分重新分散至20μL水中得到磁性材料部分溶液；

(4)电化学生物传感器的构建

将直径为2mm的磁性玻碳电极用Al₂O₃抛光成镜面，然后依次用无水乙醇、水超声洗涤2～5分钟，水冲洗干净后，氮气吹干备用；取5～8μL步骤(3)得到的磁性材料部分溶液，滴于处理过的磁性玻碳电极表面，即得到基于基因编辑技术的双信号输出检测转基因大豆的电化学传感器。

2.根据权利要求1所述的基于基因编辑技术的双信号输出检测转基因大豆的电化学传感器的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的磁性材料Fe₃O₄@AuNPs合成的具体步骤如下：

(1)将2.5～3.0g FeCl₃·6H₂O、7.5～8.0g NH₄Ac和0.5～1.0g柠檬酸钠溶解在120～150mL乙二醇中，于140～170℃和氮气保护下剧烈搅拌1小时，然后转移到聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，200℃下加热14～16小时，然后自然冷却至室温得到磁珠，将磁珠用乙醇及超纯水洗涤多次后，分散在50mL乙醇中，即得四氧化三铁纳米粒子Fe₃O₄NPs；

(2)将40～50mL Fe₃O₄NPs与0.4～0.6mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷混合，超声0.5小时后，室温下搅拌5～8小时，经磁分离、清洗、重新分散在50mL水中，即得氨基化Fe₃O₄NPs；

(3)将0.6～1.0mL的0.1～0.3mol/L NaOH溶液和0.5～0.7mL的80wt％的四羟甲基氯化磷溶液加入到27mL的水中，搅拌5分钟后，加入0.9～1.3mL的1wt％的HAuCl₄·4H₂O溶液，搅拌10～20分钟，即得Au种子溶液；

(4)在超声处理下将400～500μL氨基化Fe₃O₄NPs与0.8～1.2mL金种子溶液混合，并将混合物在室温下搅拌0.5～1小时后，分散在500μL超纯水中，即得Fe₃O₄@Au种子；将90～100μLFe₃O₄@Au种子加入到2～4mL金生长溶液中，然后加入110～130μL的0.35wt％聚乙烯吡咯烷酮水溶液和13～16μL甲醛溶液，并搅拌35～45分钟，即得到磁性材料Fe₃O₄@AuNPs；所述的金生长溶液配方如下：5.0～5.5μmol/L HAuCl₄·4H₂O和1.0～1.2μmol/L K₂CO₃的混合溶液。