[发明专利]一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法

权利要求书

1.一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

步骤一，反应体系充分反应，

催化反应：反应液A中加入200μL试剂A，37℃、200rpm摇床预混合5min，加入30-100μL稀释后的待测酶液继续反应10-30min；催化反应的反应液总量为500μL,以反应液A补足；

终止催化反应：加200μL反应终止液C至催化反应体系，70℃水浴15min，4℃、10000rpm离心取上清；

显色反应：取2.2mL反应液B加入650μL离心后上清并混匀，加入100μL试剂B，50μL试剂C，2U胆碱氧化酶，2U过氧化氢酶，放入摇床37℃、200rpm反应60min，待显色反应稳定，制得待测样品溶液；显色反应的反应液总量为3mL；

步骤二，吸光度的检测，

使用全波长酶标仪进行吸光度进行检测；取0.1mL步骤一所得的待测样品溶液加入96孔酶标板在500nm波长处检测吸光度值，每个样品做3组平行，并计算均值和方差；

步骤三，标准曲线的绘制，

制备1mg/mL氯化胆碱母液，分别取不同体积的该母液加去离子水配成0-2μmol的标准溶液；同时以去离子水为空白对照；以氯化胆碱物质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程；

步骤四，酶活计算，

酶活力即酶促反应的转化速率，可以用单位时间内单位体积中底物的减少量和产物的增加量来表示；

酶活力计算如下式所示：

酶活力(U/mL)＝D×n_胆碱/(t×V_酶液)

式中：D为酶液稀释倍数；

n_胆碱为标曲吸光度所对应氯化胆碱物质的量；

t为磷脂酶D水解时间；

V_酶液为所取酶液体积。

2.根据权利要求1所述的一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，其特征在于，步骤一中所用的试剂A、试剂B、试剂C、反应液A、反应液B以及反应终止液C为试剂盒雏形，具体组成如下：

试剂名称 组成成分

试剂A 10mg/mL卵磷脂溶液(-20℃保存)

试剂B 0.3％(W/V)4–氨基氨替吡啉(避光保存)

试剂C 2％(W/V)苯酚(避光保存)

反应液A 100mmol/L Tris-HCl(pH5.5)；25mmol/L CaCl₂；0.3％(w/v)TritonX-100

反应液B 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)

反应终止液C 0.1mol/L Tris-HCl；10mmol/L EDTA；1％(W/V)16- 烷基-3甲基氯化铵。

3.根据权利要求1所述的一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，其特征在于，所述试剂A具体是90％以上的蛋黄卵磷脂用80％的乙醇充分溶解制得。

4.根据权利要求1所述的一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，其特征在于，步骤一中反应体系的反应条件为，在37℃，pH5.5，10mmol CaCl₂条件下进行催化反应，加入反应终止液终止催化反应，在37℃，pH8.0进行显色反应。

5.根据权利要求1所述的一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，其特征在于，步骤二吸光度检测中，通过适当调整步骤一中反应液B的体积，从而改变显色反应体系，使得该体系对应的标准曲线测得的最大吸光度值在1 附近，并且是吸光度不再变化的临界点，该临界点对应的氯化胆碱物质的量为催化反应生成胆碱的最大量，此时达到对胆碱显色反应检测的上限；若检测过程中出现吸光度值为1的情况，应稀释待测样品酶液，重新检测。

6.根据权利要求1所述的一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，其特征在于，步骤四中的计算方法是通过定义在特定温度和PH下，磷脂酶D每min催化卵磷脂水解生成1μmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位；

得到酶活力定义如式(1)所示：

酶活力/(U/mL)＝(m_氯化胆碱×1000×D)/(M_氯化胆碱×t×V_酶液) (1)

式中：m_氯化胆碱为氯化胆碱的质量/mg；M_氯化胆碱为氯化胆碱的摩尔质量139.9g/mol；D为稀释倍数；t为催化反应的反应时间/min；V_酶液为酶液体积/mL；

在结合实际操作得到计算如式(2)所示：

酶活力(U/mL)＝D×n_胆碱/(t×V_酶液) (2)

式中：D为酶液稀释倍数；n_胆碱为标曲吸光度所对应氯化胆碱物质的量；t为磷脂酶D水解时间；V_酶液为所取酶液体积。