[发明专利]一种微生物活菌计数方法

权利要求书

1.一种微生物活菌计数方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)样本处理：样本去杂，清洗后得菌体悬液；

(2)叠氮溴化丙锭处理：向菌体悬液中加入叠氮溴化丙锭溶液混匀孵育，离心制备菌悬液；

(3)实时荧光定量PCR检测：以上述菌悬液为模板，直接进行实时荧光定量PCR检测，所述菌悬液不经DNA提取步骤；

(4)活菌计数：基于标准曲线计算酵母活菌浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为酵母菌和/或乳酸菌；优选的，所述微生物为酿酒酵母和/或植物乳杆菌；更优选的，所述样本为果酒样本。

3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的叠氮溴化丙锭终浓度为25-50μM，优选为25μM。

4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的孵育采用置于冰上避光并利用摇床进行孵育；优选的，冰上避光孵育10-30min，卤素灯曝光5-15min后，离心收集菌体；更优选的，先冰上避光，在摇床上以200rpm，孵育20min，然后用465nm卤素灯曝光10min。

5.如权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，当所述微生物为酵母菌时，步骤(2)进一步包括溶壁酶处理；优选的，所述溶壁酶处理时间为45min，处理浓度为75U/mL。

6.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中实时荧光定量PCR所用的特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-2和/或SEQ ID NO.7-8所示。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的清洗为：1mL生理盐水洗一次，1mL含2％(w/v)Polyvidone 25的10％TEN缓冲液洗一次，1mL生理盐水洗一次后300μl生理盐水重悬。

8.权利要求1-7任一所述的方法在监测酵母菌和/或乳酸菌活菌数中的用途。

9.一种酵母菌和/或乳酸菌活菌计数的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含叠氮溴化丙锭、检测引物及实时荧光定量PCR检测的常规试剂；所述检测引物的序列如SEQID NO.1-2所示和/或SEQ ID NO.7-8所示。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含浓度为25-50μM，优选为25μM的叠氮溴化丙锭。