[发明专利]用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针及其应用

说明书

本发明提供一种用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针及其应用，所述探针长度为20‑40 nt，与靶RNA序列严格互补配对，且与其他非靶RNA不存在连续超过15 nt的互补配对，探针的Tm值不低于80℃，自身互补值小于5，探针的3’‑OH利用修饰的脱氧核糖核苷酸进行封闭。本发明利用逆转录阻碍探针法在一链cDNA合成时实现对靶RNA的逆转录进行高效率高特异性的抑制，从而阻碍靶RNA参与下游建库过程。本发明具有操作简单（一步操作）、耗时极短（2 min）、对非靶RNA保留完整、特异性强、效率高、成本低和基因检出数高等优点，非常适合用于工业自动化建库和疾病快速诊断领域。

技术领域

本发明专利涉及用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

近年来，随着二代测序技术的快速发展，各类RNA建库技术和测序技术层出不穷并且迭代升级，大大地降低了RNA建库和测序的难度和成本，这也使得RNA二代测序技术成为生命进展和疾病诊断等领域的重要研究手段。但是，不同来源的样本中的RNA种类占比具有极大的不均一性，如正常细胞中核糖体rRNA约占总RNA的90%-95%，血液中球蛋白的mRNA约占总mRNA的76%以上，这些RNA的存在占据了大部分的测序数据，严重影响到低丰度RNA的检测，提高了测序的成本。

现在主要有两类策略来去除这些在RNA建库过程中不需要的高丰度RNA。第一类策略为磁珠捕获法。比如polyA富集法，利用oligo(dT)磁珠来捕获富集含有polyA的mRNA，这种方法只适用于完整性较好的RNA，能够捕获的RNA种类有限，大大降低了测序的多样性，而且这种方法对polyA长度越长的RNA存在捕获效率越高，会造成RNA建库的偏好性；或者靶RNA捕获去除法，利用带有biotin修饰的反义DNA探针与靶RNA杂交后，用链亲和霉素磁珠对靶RNA进行去除。另一类种策略为核酸酶降解法。比如RNase H切割去除法，利用RNase H特异性识别并降解DNA:RNA杂交链中RNA的活性对靶RNA进行降解；或者CRISPR/Cas9切割法，利用sgRNA-Cas9系统对构建好的双链DNA文库中靶RNA来源的双链DNA进行切割。这些方法存在成本高、操作复杂（约20-40步）、耗时长（约2h）、对样本来源和RNA丰度要求高、试剂难以储存等缺陷，严重阻碍了RNA二代测序建库技术的工业自动化发展和其在疾病快速诊断领域的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针，可以快速去除RNA建库中的rRNA。

本发明采用的技术方案为：

一种用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针，所述探针长度为20-30nt，与靶RNA序列严格互补配对，且与其他非靶RNA不存在连续超过15 nt 的互补配对，探针的Tm值不低于80℃，自身互补（Self complementarity）值小于5，探针的3’-OH利用修饰的脱氧核糖核苷酸进行封闭；所述探针有多个，探针覆盖靶RNA区域不低于全长RNA的1/6，探针在靶RNA上分布均匀，探针之间的距离不超过100 nt。

优选的，所述探针的脱氧核糖核苷酸包括一种或多种修饰，每种修饰的数量为1个或多个，修饰种类包括但不限于肽核酸（PNA）、锁核酸（LNA）、脱氧尿嘧啶核苷酸（dU）、MGB（核酸小沟嵌合物）、2-O-甲基核糖、5-羟基丁酸酰基-脱氧尿苷、2-氨基脱氧腺苷和5-甲基脱氧胞苷修饰，使得探针的Tm值在80℃-95 ℃之间。

优选的，所述修饰的位置靠近 探针的5’端，至少50%所述修饰的位置应处在探针5’端的前三分之一区域。

优选的，探针长度为20-30 nt，且与其他非靶RNA不存在连续超过10 nt的互补配对，自身互补值小于3。

优选的，探针覆盖靶RNA区域不低于全长RNA的1/3，探针之间的距离不超过30 nt。