[发明专利]一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括上游引物、下游引物及探针，其中上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的实时荧光PCR检测用引物探针组，其特征在于，所述探针的5'端修饰有荧光报告基团5`6-FAM、5`HEX或5`VIC，3'端修饰有含有不发荧光的淬灭基团3`BHQ1、3`BHQ2或3`BHQ3。

3.一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的引物探针组。

4.如权利要求3所述的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括2×TaqmanExpress PCR Master Mix和1-2μg/ml的阳性对照。

5.如权利要求3所述的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物、探针以引物探针混合液的形式存在，均溶解在同一TE缓冲液中。

6.如权利要求3所述的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物的工作浓度为10μmol/L，下游引物的工作浓度为10μmol/L，探针的工作浓度为10μmol/L。

7.一种不以疾病诊断为目的的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.提取DNA作为反应的模板；

S2.采用权利要求1所述的引物和探针进行实时荧光PCR检测。

8.如权利要求7所述的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述提取DNA的步骤包括：

1)采集待测样本：将待测样本充分研磨至粉末状，加TE缓冲液稀释后，得到研磨液；

2)提取样本基因组：采用磁珠法提取研磨液中的DNA，获得待测样本的模板DNA。

9.如权利要求8所述的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述待测样本为植物发病部位组织或干重组织，其与TE缓冲液的重量比例为1：1-1：5；所述研磨的粒度为40-60微米。

10.如权利要求8所述的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述磁珠法是通过植物基因组DNA提取试剂盒进行的。

11.如权利要求7所述的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述实时荧光PCR检测反应体系为25μL：模板DNA 2μl，2×Taqman Express PCR Master Mix，12.5μl；10μmol/L权利要求1所述的引物各1μL，10μmol/L权利要求1所述的探针0.5μL，和无菌水8μL。

12.如权利要求11所述的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火/延伸1min，共40个循环，并收集荧光信号。