[发明专利]一种快速、超高灵敏度的DNA融合基因检测方法

说明书

本发明提供一种DNA融合基因检测方法，该方法在不影响高灵敏性检测前提下，达到运行时间短并具有高检出特异性，同时能够准确地表征DNA测序数据中的融合基因断点、频率及拼接信息。

技术领域

本发明涉及生物信息学分析领域，特别是涉及一种快速、超高灵敏度的DNA融合基因检测的生信分析方法。

背景技术

基因组结构变异通常指的是长度大于1kbp的基因组结构改变，主要包括大片段的缺失(Deletion)，插入(Insertion)，倒置(Inversion)及易位(Translocation)^[1]。由基因组结构变异导致的不同基因间的序列拼接，通常称为融合基因。

基因融合作为一种重要的生物标记物在肿瘤的诊断、预后及治疗中提供重要的信息。例如，ALK、ROS1、RET基因融合在非小细胞肺癌中通常是独立的致癌因子，并且是靶向药作用的靶点^[2,3]。以往，肿瘤生物标记物的检测主要是对肿瘤组织样本进行检测。液体活检是一项革命性的技术，它打开了以前意想不到的前景，主要包括检测和分离循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(cfDNA)和外泌体^[4]。因其具有微创、可重复的检测方式，以及包含癌症患者基因组和蛋白质组学信息，在临床诊断中具有相当大的意义。基于液体活检和NGS测序技术检测基因融合事件对于检测软件的灵敏性及特异性要求更高。Guardant360 CDx伴随诊断产品是FDA批准的首个基于NGS测序技术检测cfDNA中基因突变的体外诊断试剂盒^[5]。此产品的融合检出性能可以达到投入量为5ng时最低检出限为1％，投入量为30ng时最低检出限为0.1％。

NGS测序技术可以一次同时检测多个基因融合，在临床检验上具有很大的优势。目前可以对DNA测序数据集(WGS、WES、区域捕获等)和RNA测序数据集的挖掘来识别。现有从DNA测序数据集挖掘基因融合信息的主要方法分为基于序列组装，Read pair(成对read分别比对到染色体不同位置)及Split read(同一条read比对到染色体不同位置)的方法^[5]。基于序列组装的方法通过对短序列进行从头组装或局部组装，拼接成较长的基因序列，再与参考序列比较发现基因结构变异。此方法可以检测结构变异的类型最多，但检出结果的准确性更依赖于序列组装的效果。基于Read pair方法主要通过比较discordant reads之间的距离与插入片段大小的差异来确定基因组结构变异，但此方法的灵敏度受到插入片段长度标准差的影响，并且不能给出结构变异的准确位置。与Read pair方法相比，基于splitread方法通过softclip read比对信息可以直接获得精确的断点的位置。此外，有些融合检测方法会同时运用上述两种方法，如FACTERA^[6]等

然而上述融合检测方法都存在各自的利弊。基于序列组装的方法，检测效果依赖于序列组装的质量，容易生成较多的假阳信息，并且序列组装的方法存在消耗大量计算资源的问题。基于Read pair的方法需要估计测序数据插入片段大小，及其与Read pair之间距离的差异，容易造成假阴和过多假阳信息的问题，并且此方法只能给出融合的大致区域。利用split reads确定融合断点是较为准确的方法，但不同检测方法具体实施过程中，也存在灵敏性不足，假阳检出偏高的问题。

此外，现有的融合发现方法往往在模拟数据中表现良好，但在临床样本中却高估真实肿瘤基因组中的断点，几乎都存在假阳性率高的问题。同时，在低肿瘤细胞占比情况下目前的检测方法对于低融合频率的检出敏感性存在缺陷，很难满足目前临检生产尤其是液体活检的敏感性要求。简化分析步骤，缩短运行时间，特别是低肿瘤基因组占比样本中融合事件的准确检测成为本领域面临的重大难题。

有鉴于此，提出本发明。