[发明专利]一种金针菇J3931菌种的SSR标记指纹图谱的鉴定方法及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种金针菇J3931菌种的SSR标记指纹图谱的鉴定方法，其特征在于：所述指纹图谱包括6对SSR标记，具体序列如下：

2.权利要求1所述的金针菇J3931菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：包括，

(1)菌丝培养：将金针菇菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃培养7d后收集菌丝；

(2)基因组DNA的提取：用TAKARA公司的TaqHotStart扩增试剂盒提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；

(3)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；

(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与甲酰胺加样缓冲液混匀，变性，上机检测；

(5)GeneMapper数据分析。

3.根据权利要求2所述的金针菇J3931菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)基因组DNA的提取，其具体方法包括：

(1)将菌丝样本加入液氮充分研磨；

(2)向研磨好的粉末中迅速加入360μL BufferSTE和40μL Buffer SDS，迅速涡旋混匀后，将离心管放在65℃水浴15min，水浴过程中颠倒离心管以混合样本数次；

(3)加入5μL RNase Solution至裂解液中，涡旋混匀，室温静置15-30min；

(4)加入140μL Buffer PS，涡旋震荡30s，冰上放置10min；

(5)室温下，13000g离心5min，小心转移400μL上清液至新的离心管中；

(6)加入600μL Buffer PBD至样品中，涡旋混匀30s；

(7)把DNA结合柱装在收集管，转移一半混合液至柱子中，8000g离心1min；

(8)倒弃滤液把柱子装回收集管，转移剩余混合液至柱子中，8000g离心1min；

(9)倒弃滤液把柱子装回收集管，加入600μL Buffer GW2至柱子中，8000g离心1min；

(10)重复步骤9；

(11)倒弃滤液把柱子装回收集管，10000g离心2min去除柱子中残留的乙醇；

(12)将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入30μL预热至65℃的Buffer AE至柱子的膜中央，室温静置2min，10000g离心1min；

(13)取2μL DNA用于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μL DNA用于NanoDrop分光光度计测浓度，剩余DNA保存于-20℃。

4.根据权利要求2所述的金针菇J3931菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述PCR扩增，扩增体系为：总体积10μL，包括：10×PCR buffer 1μL，2.5mmol/L dNTP 0.8μL，5U/μL HSTaq DNA酶0.1μL，5μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各0.6μL，浓度20ng～30ng/μL提取的模板DNA 1μL，ddH₂O 5.9μL；

PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 30second，59℃ 30second，72℃ 30second，35个循环；60℃ 30min。

5.根据权利要求2所述的金针菇J3931菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述将上述PCR扩增得到的产物与甲酰胺加样缓冲液混匀，其中，加样缓冲液的分子量内标与甲酰胺的体积比为0.5：8.5，所述加样缓冲液的分子量内标与甲酰胺的体积共9μL；PCR扩增得到的产物加样量1μL。

6.根据权利要求2所述的金针菇J3931菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述变性，为95℃变性3min，结束后置于冰水混合物中冷却3min。