[发明专利]一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉的制备及复苏方法

权利要求书

1.一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

干细胞的培养，用含有自体血清的DMEM培养基培养人间充质干细胞；

上清液的收集，收集低传代人间充质干细胞培养上清液；

冻干粉的制备，将收集到的上清液离心，在去除离心管上层30％～33％的上清液后，将离心管中剩余的上清液转移至一收集管中，弃沉淀，再对所述收集管中的上清液低温冻存凝固后，再真空冷冻制得冻干粉。

2.根据权利要求1所述的人间充质干细胞培养上清液冻干粉制备方法，其特征在于：在对所述收集管中的上清液低温冻存凝固之前，在所述收集管中的上清液中加入占总体积18％的甘露醇、占总体积3％的右旋糖酐、占总体积1％的人白蛋白、占总体积0.7％的维生素C和占总体积10％的丙二醇后震荡混匀。

3.根据权利要求1所述的人间充质干细胞培养上清液冻干粉制备方法，其特征在于：所述低传代指的是人间充质干细胞传代在5代以内，所述DMEM培养基含有10vol％自体血清以及青霉素lOOU/mL和链霉素lOOU/mL。

4.根据权利要求1所述的人间充质干细胞培养上清液冻干粉制备方法，其特征在于：所述低温冻存凝固是在温度为-80℃的超低温冰箱中进行，所述真空冷冻是在真空度1Pa、冷温度-70℃的真空冷冻机中进行。

5.根据权利要求1所述的人间充质干细胞培养上清液冻干粉制备方法，其特征在于：所述干细胞的培养包括人间充质干细胞分离制备和人间充质干细胞的传代培养。

6.根据权利要求5所述的人间充质干细胞培养上清液冻干粉制备方法，其特征在于：所述人间充质干细胞分离制备的步骤为：将足月产的婴儿脐带从保存液中取出，放入含有75vol％酒精的无菌培养皿内，浸泡30s-1min，再用0.9％的生理盐水洗涤脐带组织，直至无明显血块，剪取脐带使每段2-3cm；将脐带纵向剖开，剔除1根脐静脉血管和2根脐动脉血管，撕取华通胶；用生理盐水充分洗涤华通胶3次后，将其剪碎成1mm³～3mm³大小的组织块；将组织块接种于培养瓶中，放置于37℃，5vol％的CO₂的培养箱中贴壁2h，添加15ml无血清完全培养基，置于培养箱中培养，培养最初7d，保持培养瓶绝对静止；8d在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出；12d细胞数量较多，去除组织块，用胰蛋白酶消化将贴壁细胞转移至新的T175培养瓶中培养以备进行人间充质干细胞的传代培养。

7.根据权利要求5所述的人间充质干细胞培养上清液冻干粉制备方法，其特征在于：所述人间充质干细胞的传代培养的步骤为：将T175培养瓶中的人脐带间充质干细胞加入40mlDMEM培养基，放入37℃，5vol％CO₂培养箱中培养，当生长到85-90％汇合度时，收集培养上清液，将人脐带间充质干细胞与新鲜DMEM培养基混合，继续用于细胞的扩大培养，如此反复至细胞传代至5代以内后，所产生的全部细胞培养上清液可供收集。

8.一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉，其特征在于：根据权利要求1-7任一项所述的人间充质干细胞培养上清液冻干粉制备方法制得的人间充质干细胞培养上清液冻干粉。

9.一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉的复苏方法，其特征在于：将权利要求1-7任一项所述的离心管上层30％～33％的上清液与权利要求9所述的冻干粉混合摇匀。

10.据权利要求9所述的人间充质干细胞培养上清液冻干粉的复苏方法，其特征在于：所述离心管上层30％～33％的上清液与所述的冻干粉按照3ml：50mg的比例混合。