[发明专利]一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌，其特征在于，所述含突变纳豆激酶重组基因的工程菌命名为Komagataella phaffiiLNF012，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.20498。

2.一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）获得纳豆激酶前导肽-成熟肽基因片段NKt：以枯草芽孢杆菌DNA为模板，以Primer 1和Primer 2为引物，通过PCR方法扩增出NKt基因片段；

NKt基因片段引物序列为：

Primer1：5’-GCGGAATTCGGCCGGAAAAAGCAGTAC-3’

Primer2：5’-GCGCTCGAGTTGTGCAGCTGCTTGTAC-3

2）获得NKt₁₉₄突变片段：以NKt基因片段为模板，Primer 1和Primer 3为引物通过重叠延伸PCR扩增突变的上游片段NKt₁₉₄F；以NKt基因片段为模板，Primer 4和Primer 2为引物通过重叠延伸PCR扩增下游片段NKt₁₉₄R，通过T4连接酶，16℃过夜连接，将NKt₁₉₄F和NKt₁₉₄R连接合成NKt₁₉₄突变片段；

突变的上游片段NKt₁₉₄F引物序列为：

Primer 1：5’-GCGGAATTCGGCCGGAAAAAGCAGTAC-3’

Primer 3：5’-AGCCATTACATCAAGCTCTGGTCCTACGCTGGAGAATG-3’

下游片段NKt₁₉₄R引物序列为：

Primer 4：5’-CATTCTCCAGCGTAGGTCCAGAGCTTGATGTAATGGCT-3’

Primer 2：5’-GCGCTCGAGTTGTGCAGCTGCTTGTAC-3’

3）密码子优化：根据毕赤酵母X33密码子偏爱性对NKt₁₉₄突变片段进行优化和合成，获得优化的基因片段NKt2；优化的基因片段NKt2基因序列如SEQ ID NO.1所示；

4）将优化的基因片段NKt2与表达质粒PGAPZα-A分别在酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，然后T4连接酶连接，构建重组载体PGAPZα-A-NKt2；

5）将重组载体PGAPZα-A-NKt2转化到毕赤酵母X33中，获得含突变纳豆激酶重组基因的工程菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤1）中，PCR方法扩增的条件为：

PCR反应体系：Primer 1 2μl，Primer 2 2μl，2×Es taq Master Mix 25μl；枯草芽孢杆菌DNA 1μl，ddH₂O补至总体系50μL；

PCR反应条件：94℃预变性2 min；94℃ 30s；53℃ 30s；72℃ 30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃ 10min。