[发明专利]枇杷三萜酸合成关键酶基因EjCYP716A1/2和EjCYP716C1/2及应用

说明书

本发明公开了枇杷三萜酸合成关键酶基因EjCYP716A1/2和EjCYP716C1/2及应用。本发明首先揭示了一个新的氧化鲨烯环化酶基因EjOSC2在三萜酸合成过程中合成α/β‑香树精的功能；阐明了基因EjCYP716A1/2在α/β‑香树精C‑28位上催化氧化反应，使其转化为熊果酸和齐墩果酸的功能；并阐明了EjCYP716C1/2在熊果酸/齐墩果酸C‑2位上催化羟化反应，使其转化为科罗索酸/山楂酸的功能。这5个基因可以为调节药用植物枇杷叶片等组织中乌苏烷型和齐墩果烷型三萜酸积累水平提供基因资源，也为通过基因编辑或发酵工程等环境友好型生产工艺批量生产枇杷熊果酸、科罗索酸等天然活性三萜酸组分奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及枇杷三萜酸合成关键酶基因EjCYP716A1/2和EjCYP716C1/2及应用。

背景技术

枇杷是重要的药食两用的常绿果树，除果实鲜美备受消费者喜爱外，干叶是部分重要天然产物的主要供体之一，不但在传统中药中被广泛利用，在现代生物医药开发中也同样颇受关注。三萜酸是枇杷叶中含量最为丰富的一类天然活性化合物，随着检测技术的不断发展，近二十年来科研人员已从枇杷叶中鉴定到了几十种三萜酸组分。生物活性评价及药理研究表明，熊果酸、科罗索酸等主要三萜酸在癌细胞抑制、杀菌消炎、降血糖等疾病治疗中发挥重要活性，在医药、食品等领域得到广泛重视与利用。对枇杷而言，其常用药源叶片采自果品生产树，各种组分的生产需要通过繁琐的工艺流程从大量叶片中分离单独三萜酸组分。传统制备工艺的使用影响枇杷鲜果生产，同时提取环节消耗大量人力物力，且容易带来工业污染。利用工程菌或植物等生物底盘表达代谢产物合成相关基因，既可以减少叶片采摘对果品生产的影响，又可以批量定向生产靶标组分，是一种环境友好型化合物合成途径。

鉴定三萜酸生物合成结构基因并建立表达系统是保障生物合成及定向生产靶标组分的关键。虽然已有研究人员报道了几个枇杷三萜酸合成相关基因的片段，但这些研究都未在空白对照下鉴定相关合成基因的功能。专利CN110938640A公开了一个合成α-香树精的氧化鲨烯环化酶基因EjAAS1，但未鉴定其他具有相似功能的同源基因；对于叶片中高含量的熊果酸和科罗索酸以及齐墩果酸和山楂酸等三萜酸的合成酶基因也还没有鉴定和挖掘。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供枇杷三萜酸合成关键酶基因EjCYP716A1/2和EjCYP716C1/2及应用。

本发明的第一个目的是提供核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的任一基因，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的任一蛋白，在促进枇杷生成三萜酸中的应用。

本发明的第二个目的是提供核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的任一基因，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的任一蛋白，在促进α-香树精生成熊果酸、α-香树精生成科罗索酸、β-香树精生成齐墩果酸、和/或β-香树精生成山楂酸方面的应用。

本发明的第三个目的是提供一种提高乌苏烷型和/或齐墩果烷型三萜酸产量的方法。

本发明的第四个目的是提供核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示的任一基因，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的任一蛋白，在促进枇杷生成乌苏烷型和/或齐墩果烷型三萜酸中的应用。

本发明的第五个目的是提供核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示的任一基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的任一蛋白，在促进熊果酸生成科罗索酸，和/或促进齐墩果酸生成山楂酸中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种提高科罗索酸和/或山楂酸产量的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：