[发明专利]一种山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测的引物及其在HRM检测试剂中的应用

说明书

本发明提供一种山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测的引物及其在HRM检测试剂中的应用，涉及分子生物学技术领域。本发明的引物根据ENTV‑2全基因组序列及与ENTV‑2同源性较高的病毒如ENTV‑1、JSRV、ERVs等病毒的基因序列进行比对设计，对应的PCR扩增目的片段长度为108bp，该引物应用于HRM检测试剂中，可通过分析PCR产物的溶解曲线，根据特异的溶解峰和TM值，鉴定扩增产物是否为目的片段，无需特异的探针，无需测序，全程闭关操作，提高了实验的准确性，具有特异性强、重复性好、快速和成本低的优点，适用于羊鼻内肿瘤的边境检验检疫，本发明填补了国内外该领域研究的空白，具有重要的经济意义。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体是涉及一种山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测的引物及其在HRM检测试剂中的应用。

背景技术

山羊地方性鼻内肿瘤(Enzootic nasal tumor，ENT)是一种以患病羊的鼻甲骨筛骨上皮细胞发生恶性转化为特征的慢性、进行性、接触性传染病，临床症状主要病羊食欲减退，持续流鼻液，呼吸困难，后期发展为大量鼻漏，极度消瘦，部分出现眼部突出和颅骨变形，剖检可见鼻腔内一侧或两侧出现菜花样肿瘤；该病发病率不高，约为0.5-15％，但死亡率可达到100％，潜伏期长达数月甚至一年，给羊养殖业造成重大的损失和潜在威胁；该病尚无疫苗用于预防，且发病早期症状不易与羊常见呼吸道疾病区分，因此，急需一种敏感、特异的对发病羊和羊群进行早期诊断的方法，以便对感染羊进行淘汰，保护健康羊群。

由于目前山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)无法体外培养，未建立血清学的检测方法，因此主要依靠分子生物学检测，已建立了包括RT-PCR与限制性内切酶分析鉴定ENTV的方法，RT-PCR方法，实时荧光定量PCR检测方法与Taqman实时荧光定量PCR。检索到CN201610311800.4的中国发明专利公开了一种用于检测羊地方性鼻内肿瘤病毒基因的引物对及其应用，和CN202010013356.4的中国发明专利公开的一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒.

然而普通PCR敏感度不够高，临床应用中容易漏检，荧光定量的方法由于不饱和染料的添加，对结果有较大影响，Taqman的方法需要探针，价格较为昂贵。高分辨率熔解曲线(high resolution meltingcurve，HRM)是美国Utah大学Wittwer实验室首次提出的基于新型饱和突光染料的发明而进行分子生物学检测的技术。多应用于检测基因突变，具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、闭管操作等优点，目前国内外尚无将HRM方法用于山羊地方性鼻内肿瘤中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测的引物及其在HRM检测试剂中的应用，根据ENTV-2全基因组序列及与ENTV-2同源性较高的病毒如ENTV-1、JSRV、ERVs等病毒的基因序列进行比对设计引物，并将该引物应用于HRM检测试剂中，在q-PCR反应体系中加入饱和荧光染料，通过PCR产物扩增曲线和溶解曲线对结果进行分析，具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、闭管操作等优点，目前国内外尚未有报道将HRM方法应用于检测ENTV-2。该方法能快速准确地鉴定ENTV-2，适用羊鼻内肿瘤的边境检验检疫。

为实现上述目的，本发明提供一种山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)检测的引物及其在HRM检测试剂中的应用，所述引物根据山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列及与山羊地方性鼻内肿瘤病毒同源性较高的病毒基因序列进行比对设计，对应的PCR扩增目的片段长度为108bp，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。序列如下：

S1-enHRM1223(SEQ ID NO.1)：5’-TCATACTGTGGATTCCCTGTC-3’和R2-enHRM1223(SEQ ID NO.1)：5’-CTAACTACATCATATAAAGCTGATAGTC-3’。