[发明专利]基于金属有机框架材料的CRISPR/Cas荧光传感器及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于金属有机框架材料的CRISPR/Cas荧光传感器，包括荧光‑荧光猝灭材料、cDNA‑MC‑LR适配体复合体和sgRNA‑Cas14a蛋白复合体，其中：荧光‑荧光猝灭材料主要由金属有机框架材料和荧光报告分子组成；cDNA‑MC‑LR适配体复合体主要由MC‑LR适配体和其互补链cDNA复合组成；sgRNA‑Cas14a蛋白复合体主要由Cas14a蛋白和sgRNA复合组成，sgRNA与cDNA的核苷酸序列互补。CRISPR/Cas荧光传感器，能够检测MC‑LR含量，对环境和食品中的痕量MC‑LR也能够进行检测，灵敏度高，检测结果准确。还公开了其制备方法和应用，操作简单，成本低。

技术领域

本发明属于微囊藻毒素-LR检测技术领域，尤其涉及基于金属有机框架材料的CRISPR/Cas荧光生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

水体富营养化所引发的藻类污染是目前我国环境整治面临的重大挑战。近年来我国蓝藻水华频发，所引起的微囊藻毒素（MCs）的污染越发严重，我国太湖、巢湖、滇池等大型淡水湖泊以及许多水库和养殖水体均检测到了MCs（最高达54.898 μg/L）。在MCs的众多衍生物中，又以微囊藻毒素-LR（MC-LR）含量最为丰富（约占天然水体中MCs总浓度的99.8%），毒性最强。MC-LR具有很强的肝、肾、神经、免疫和生殖毒性，是一种强烈的促癌剂。世界卫生组织规定生活饮用水卫生标准MC-LR浓度限值为1.0 μg/L。我国卫健委沿用了该标准，并规定微囊藻毒素为饮用水水质必检项目之一。

常用的MC-LR检测方法包括高效液相色谱法、高效液相色谱/质谱联用、蛋白磷酸酯酶抑制法和竞争性酶联免疫吸附分析法等。然而，这些方法存在样品前处理过程繁琐、耗时长、仪器昂贵且或易存在基体效应等缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种灵敏、准确的基于金属有机框架材料的CRISPR/Cas荧光传感器及其制备方法，以及该CRISPR/Cas荧光传感器在检测MC-LR中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种基于金属有机框架材料的CRISPR/Cas荧光传感器，包括荧光-荧光猝灭材料、cDNA-MC-LR适配体复合体和sgRNA-Cas14a蛋白复合体，其中：

所述荧光-荧光猝灭材料主要由金属有机框架材料和吸附在该金属有机框架材料上的荧光报告分子组成；

所述cDNA-MC-LR适配体复合体主要由MC-LR适配体和互补链cDNA复合组成，所述互补链cDNA的核苷酸序列与所述MC-LR适配体上含有的任意一段核苷酸序列互补；

所述sgRNA-Cas14a蛋白复合体主要由Cas14a蛋白和sgRNA复合组成，所述sgRNA的核苷酸序列与所述互补链cDNA的核苷酸序列互补。

CRISPR-Cas系统由簇状规则间隔短回文重复序列（Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）和CRISPR关联蛋白（CRISPRassociated，Cas）组成，是一种古生菌和细菌的适应性免疫系统，具有独特的精准识别和DNA剪切能力。最近研究发现，Cas14a蛋白在不需要PAM序列的条件下可以识别单链DNA，而后激发其反式切割活性，即对体系中任意单链DNA进行不加区别的切割。这种切割活性赋予的信号放大作用，使其具有开发高灵敏检测方法的潜能。但是，基于CRISPR的检测方法开发中，标记在切割DNA两端的荧光基团和猝灭基团价格昂贵，且猝灭效率有限。