[发明专利]定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法

说明书

本发明涉及一种定量检测牛乳中过敏原α‑乳白蛋白的双抗体夹心法，本方法包括步骤：α‑乳白蛋白兔多克隆抗体的制备及鉴定，α‑乳白蛋白鼠单克隆抗体的制备与鉴定，α‑乳白蛋白双抗夹心ELISA检测方法的建立。与现有技术相比，本发明具有较高的灵敏度，特异性，精密度和准确度，能够满足牛乳中α‑乳白蛋白过敏原的检测要求。

技术领域

本发明涉及免疫分析技术领域，，尤其是涉及一种定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法。

背景技术

食物过敏(对贝类和水果、蔬菜以外的食物过敏)在儿童中的发病率要比在成年人中更为常见、更高。牛奶、鸡蛋、小麦和大豆诱发的食物过敏在儿童中比成人中更常见。而且食物过敏与其他特应性疾病(包括特应性皮炎、哮喘和变应性鼻炎)的并发率也很高。特别是中度和重度特应性皮炎的儿童似乎有显着风险(约35％)的食物过敏。在成年人中没有类似的研究，因此在特应性皮炎的成年人中同时发生食物过敏的发生率尚不清楚。皮肤反应是食物过敏的最常见表现，包括IgE介导的(荨麻疹、血管性水肿、潮红和瘙痒)，细胞介导的(接触性皮炎和疱疹样皮炎)以及混合的IgE和细胞介导的(特应性皮炎)反应。急性荨麻疹是IgE介导的食物过敏的常见表现，尽管食物过敏不是急性荨麻疹的最常见原因，也很少是慢性荨麻疹的原因。荨麻疹是经历食物诱发过敏反应的患者的最常见症状。食物过敏症状通常在进食令人讨厌的食物后几分钟到两小时内出现。最常见的食物过敏体征和症状包括：口中刺痛或发痒，荨麻疹、瘙痒或湿疹，嘴唇、面部、舌头、喉咙或身体其他部位肿胀，喘息、鼻塞或呼吸困难，腹部疼痛、腹泻、恶心或呕吐，头晕、头晕或昏厥。对于某些人来说，对特定食物的过敏反应可能会感到不舒服，但并不严重。对于其他人来说，食物过敏反应可能会令人恐惧，严重时会导致休克甚至危及生命。目前，尚无有效的治疗手段来对食物过敏进行治疗，唯一的办法就是严格避免摄入含有过敏原的食物。

牛乳具有高蛋白质含量和均衡营养，因此被广泛用于食品工业。牛乳过敏在临床上是指机体对牛奶蛋白的异常免疫反应，一般认为是一种或多种牛奶蛋白与IgE介导的反应之间的相互作用所致。不涉及免疫系统的反应则被定义为牛奶蛋白不耐受。牛乳主要蛋白质是80％的酪蛋白和20％乳清蛋白。酪蛋白分为α-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白和γ-酪蛋白；乳清蛋白包括：α-乳白蛋白(α-LA)，β-乳球蛋白(β-LG)，牛血清白蛋白(BSA)，免疫球蛋白及含量甚微的乳铁蛋白等。研究表明牛乳中含有20多种可引起过敏反应的蛋白质，其中酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是最主要的过敏原物质。

α-乳白蛋白与溶菌酶在基因和结构上属于同源的，它是一个两结构域蛋白，由123个氨基酸残基的单条多肽链组成，并具有四个二硫键。牛乳中α-乳白蛋白类似于人乳中的α-乳白蛋白，故将其用于制备氨基酸组成几乎相似的婴儿食品中，它同时也是乳清中含量第二高的蛋白质，分子量为14.4kDa。据不完全统计，由α-乳白蛋白引起的牛乳过敏超过了51％。

在全球范围内，患有过敏性疾病的人群约占到全球总人口的25％，世界卫生组织(WHO)在20世纪末已将“食物过敏”列为21世纪重大卫生问题之一。我国对过敏原的法律法规也在逐步完善，旨在有效保护患有过敏性疾病人群的健康和安全。牛乳过敏属于食物过敏问题之一，目前尚无有效的牛乳主要过敏原诊断措施，而在食品及饮料的加工生产过程中，可能会产生交叉污染。因此，建立一个方便，快捷，灵敏，特异的牛乳主要过敏原检测方法，对于保障公众健康和安全意义重大，同时也为与国际接轨的过敏原标识制度提供了理论基础。

发明内容

酶联免疫分析是基于生物学演变而来的。酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)，也称为酶免疫测定，是一种生物化学程序，通过酶促反应产生的信号用于检测和定量溶液中特定物质的量。酶联免疫吸附测定(ELISA)通常用于检测抗原，也可以用于其他物质的检测，包括抗体、激素和药物等。ELISA具有灵敏度高、特异性强，且成本低等优点。