[发明专利]一种醛缩酶突变体及其在生产1,3-丙二醇中的应用

说明书

本发明涉及合成生物学及微生物发酵技术领域，具体的说，本发明涉及半理性设计对脱氧核糖‑5‑磷酸醛缩酶的改造以及在重组大肠杆菌中过表达四种酶:甲醇脱氢酶、乙醇脱氢酶、脱氧核糖‑5‑磷酸醛缩酶、1,3‑丙二醇氧化还原酶或1,3‑丙二醇氧化还原酶同工酶，构建非天然的由甲醇、甲醛一碳化合物和乙醇、乙醛转化为1,3‑丙二醇的生产途径的方法。本发明筛选出的DERA_TMAS233D突变体，相较野生型酶活力提高51％；在利用大肠杆菌实现由甲醛和乙醇到PDO的转化时，PDO的产量提高了21.8％；由甲醛和乙醛到PDO的转化时，PDO的产量提高了9.2％，大大缩短PDO合成途径，提高PDO的产量。

技术领域：

本发明涉及合成生物学及微生物发酵技术领域，具体的说，本发明涉及半理性设计对酶的改造以及在重组大肠杆菌中过表达四种酶:甲醇脱氢酶、乙醇脱氢酶、脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶、1,3-丙二醇氧化还原酶或1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶，构建非天然的由甲醇、甲醛一碳化合物和乙醇、乙醛转化为1,3-丙二醇的生产途径的方法。

背景技术：

甲醛(Formaldehyde)可以来源于甲醇(Methanol)、甲酸(Formate)和甲烷(Methane)，是一种重要的一碳化合物代谢中间体，可用于微生物体的生长以及合成化学品(Bennett et al.,2018；Hwang et al.,2018；Pieja et al.,2017；Zhang et al.,2018)。这些年，对于甲醛的利用，主要有三种不同的天然代谢途径：(1)核酮糖单磷酸途径(RuMP，ribulose monophosphate pathway)、(2)丝氨酸途径(serine pathway)和(3)卡尔文循环(CBB，Calvin-Benson-Bassham pathway)(Zhang et al.,2017)。其中研究最广泛的甲醛利用途径是RuMP途径。该途径通过3-己酮糖-6-磷酸合成酶(Hps，3-hexulose-6-phosphatesynthase)催化核酮糖-5-磷酸(Ru5P，ribulose-5-phosphate)与甲醛的羟醛缩合反应，生成己酮糖-6-磷酸(Hu6P，hexulose-6-phosphate)，然后通过6-磷酸-3-己糖异构酶(Phi，6-phospho-3-hexuloisomerase)异构化形成果糖-6-磷酸(F6P，fructose-6-phosphate)，随后进入中心代谢途径(如：EMP途径，ED途径)和Ru5P的再生途径(戊糖磷酸途径，PPP)(Müller et al.,2015)(Whitaker et al.,2015；Zhang et al.,2017)。在RuMP途经被广泛应用于甲醛同化的同时，也暴露出了它的很多局限性，其中最关键的一点就是RuMP途径大大受限于Ru5P受体低效率的再生(Hwang et al.,2018)。

1,3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，具有许多应用(Saxena et al.,2009；Zeng,2019)。例如医药、纺织品、涂料、塑料、化妆品和其他个人护理产品的生产。其中最主要的用途是作为单体用于合成聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)，其被认为比以乙二醇为单体合成的聚酯(PET)具有更优良的特性，可作为一种具有潜在利用价值的塑料，有可能取代传统的聚对苯二甲酸乙二酯(PET)和聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)(Bhatia and Kurian,2008)。其合成方法主要集中于化学法和生物法。

PDO的化学法合成主要包括：丙烯醛水合法，环氧乙烷羰基化法，甲醛乙醛缩合法，乙烯反应法和3-羟基丙醛加氢。由于在工业生产过程中需要高温，高压和昂贵的催化剂，以及排放有毒物质，不符合国内未来的工业要求。随着合成生物学技术的发展，利用微生物进行PDO的生产受到越来越多地研究人员关注。生物法反应条件温和，易于操作，绿色环保，成为PDO制备领域中的研究热点和趋势(Wang et al.,2019；Zhang et al.,2019)(Zeng,2019)。相比化学法，其更为环保的生产方式对于未来工业发展具有重要意义。