[发明专利]一种牛胎盘外泌体的制备方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种牛胎盘外泌体的制备方法。本发明结合胎盘的结构特点通过冻融、两次特定的超声、过滤等物理学方法有效地去除了牛胎盘组织中其他杂质成分，最终获得了富含外泌体的无菌产物。该方法对牛胎盘外泌体的提取率高，工艺稳定性好。实验表明，本发明制得的牛胎盘外泌体具有良好的完整性和生物学活性，在一定的浓度范围内，具有促进人皮肤成纤维细胞增殖的功效。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种牛胎盘外泌体的制备方法。

背景技术

近年来动物胎盘的研究不断增多，许多动物胎盘如牛、羊、鹿、驴等的生理活性被不断发现。动物胎盘提取物是来源于动物胎盘的一类复合活性成分，含有丰富的氨基酸、蛋白质、卵磷脂、多糖体、维生素、矿物元素等，具有增强记忆、抗应激、调节内分泌、增强免疫力、延缓衰老等功效，根据目前相关研究报道，胎盘提取物具有促进末梢血液循环、促进细胞及组织呼吸、去除自由基、保湿、免疫赋活及美颜等多种生物学作用。目前，已有多种利用胎盘提取有效活性物质的专利。这些专利获取胎盘提取物的方法主要以下3种：(1)直接提取法：胎盘组织经匀浆后加提取液提取，或胎盘匀浆后反复冻融法提取，提取液离心、冻干即可。(2)超临界CO2萃取法：胎盘组织冻干、粉碎、超临界萃取后，萃取物匀浆、离心，冻干离心液。(3)酶辅助提取法：胎盘经1-2种蛋白酶适度酶解后，离心、冻干离心液。这些胎盘提取物的制备方法及产品存在以下缺点：(1)获得的胎盘提取物以大分子蛋白为主，人体吸收效率低；(2)缺乏提取液精制工艺，产品成分复杂，品质低；(3)提取方法简单粗放，提取效率低，原料利用率低。因此，如何有效地获得动物胎盘中的生物活性成分并充分发挥其功效，具有重要的科学及产业化意义。

外泌体(Exosome)是由细胞内囊泡结构释放到细胞外的一种膜性囊泡，直径约30-150nm，细胞在正常的生理状况下都会分泌外泌体，由于质膜和多泡体之间融合的结果，外泌体样囊泡通过胞吐作用被分泌到胞外空间。外泌体样囊泡被脂质双层分为内部和外部，由于其含有膜脂质、膜蛋白、遗传物质和细胞质成分，间接地反映出细胞的性质和状态。同时，外泌体样囊泡通过与其他细胞和组织的结合，并将膜成分、mRNA、miRNA、蛋白质(生长激素、细胞因子等)等转移至受体细胞，而作为介导细胞-细胞之间通讯的胞外运输蛋白。

动物外泌体广泛存在于活体动物体内，动物外泌体选择性包裹脂质、蛋白质、mRNA及miRNA等多种生物活性物质，可以透皮吸收，被靶细胞摄取，可以明确减轻组织损伤程度、促进损伤组织形态学及功能学的修复，它可能还具有潜在的调节机体免疫、调控细胞生长分化等生物学功能。因此，建立动物胎盘外泌体，尤其是牛胎盘外泌体的制备工艺，可以为安全、稳定且有效的基于动物外泌体的化妆品新原料研发及产业化奠定基础。

然而，目前的制备工艺主要以制备胎盘提取物为主，制备工艺简单粗放，提取效率低，原料利用率低，工艺稳定性差，缺乏提取液精制工艺，产品成分复杂，品质低。同时缺乏统一的质量控标准及质量控制指标，最终导致无法形成安全、稳定且质量可靠的产品。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种牛胎盘外泌体的制备方法。该方法对牛胎盘外泌体的提取率高，工艺稳定性好，且制备的牛胎盘外泌体具有良好的完整性和生物学活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种牛胎盘外泌体的制备方法，包括：

取牛胎盘匀浆，匀浆液冻融；

将解冻后的匀浆液进行第一轮超声处理，过滤，滤液-80℃冷冻保存；

滤液4℃解冻，离心，取上清液进行第二轮超声处理，经滤网多级过滤，获得牛胎盘细胞外泌体；

所述第二轮超声为每间隔8s进行一次超声，每次超声时间为8s，所述第二超声的功率为100～700w，超声累计的总时间为30～60min。