[发明专利]一种西地那非信号通路基因检测试剂盒及其检测方法和应用

权利要求书

1.一种西地那非信号通路基因检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒对GNB3、NOS3、NOS1三个基因的多态性设计特异性扩增引物，用于荧光定量PCR检测，所述试剂盒包括如下组分：GNB3反应液、NOS3反应液、NOS1反应液、阳性对照、空白对照和酶。

2.根据权利要求1所述的西地那非信号通路基因检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为XDNF阳性对照，包括为GNB3、NOS1和NOS3三个位点10⁴copies野生型质粒等比混合、三个位点10⁵copies野生型、突变型质粒等比混合和三个位点10⁴copies突变型质粒等比混合。

3.根据权利要求1所述的西地那非信号通路基因检测试剂盒，其特征在于，所述GNB3的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4所示。

4.根据权利要求1所述的西地那非信号通路基因检测试剂盒，其特征在于，所述NOS1的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:11所示。

5.根据权利要求1所述的西地那非信号通路基因检测试剂盒，其特征在于，所述NOS3的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:16～SEQ ID NO:19所示。

6.一种根据权利要求1～5任一所述的西地那非信号通路基因检测试剂盒的基因检测方法，其特征在于，所述基因检测方法采用荧光定量PCR对人体全血样本中的GNB3、NOS1和NOS3三个SNP位点进行检测，扩增体系为20μL体系。

7.根据权利要求6所述的西地那非信号通路基因检测方法，其特征在于，所述扩增体系各组分分别为：

GNB3(C825T)反应液：GNB3前引物(0.25uM)，GNB3后引物(0.25uM)，GNB3(C825T)C等位基因探针GNB3-CP(0.15uM)，GNB3(C825T)T等位基因探针GNB3-TP(0.3uM)，PCR Buffer(1.5×)，dNTPS(0.3mM)、HS-Taq酶(1U)，BSA(0.05mg/ml)，海藻糖(0.2％)，无核酸酶水(将体系补充至18.5μL)；

NOS3(T-786C)反应液：NOS3前引物(0.2uM)，NOS3后引物(0.2uM)，NOS3(T-786C)C等位基因探针NOS3-CP(0.2uM)，NOS3(T-786C)T等位基因探针NOS3-TP(0.3uM)，PCR Buffer(1.5×)，dNTPS(0.3mM)、HS-Taq酶(1U)，BSA(0.05mg/ml)，海藻糖(0.2％)，无核酸酶水(将体系补充至18.5μL)；

NOS1(C276T)反应液：NOS1前引物(0.2uM)，NOS1后引物(0.2uM)，NOS1(C276T)C等位基因探针NOS1-CP(0.15uM)，NOS1(C276T)T等位基因探针NOS1-TP(0.25uM)，PCR Buffer(1.25×)，dNTPS(0.3mM)、HS-Taq酶(1U)，BSA(0.05mg/ml)，海藻糖(0.2％)，无核酸酶水(将体系补充至18.5μL)。

8.根据权利要求6所述的西地那非信号通路基因检测方法，其特征在于，所述扩增条件为95℃5min，95℃15sec，60℃30sec，扩增40cycles。

9.根据权利要求6所述的西地那非信号通路基因检测方法，其特征在于，所述人体全血样本采用DNA抽提试剂盒抽提全血基因组DNA，抽提后的基因组DNA浓度应大于10ng/μL，A260/A280比值应介于1.7-2.0之间，A260/A230比值应介于1.9-2.5之间。

10.一种根据权利要求1～9任一所述的西地那非信号通路基因检测试剂盒的应用，其特征在于，所述检测试剂盒对西地那非信号通路的三个核心基因GNB3(C825T)、NOS3(T-786C)、NOS1(C276T)进行荧光定量PCR检测，以获得西地那非NO信号通路的增强能力水平。