[发明专利]一种恶臭假单胞菌烯醇酶基因克隆方法与应用

说明书

本发明公开一种恶臭假单胞菌烯醇酶基因克隆方法与应用。本发明针对PHA合酶在粗甘油中耐受力比较弱的问题，从恶臭假单胞菌烯醇酶基因组出发，加入引物PCR成功扩增得到1290bp的片段，通过酶切连接成功构建了载体pET28a‑Eno，经酶切和测序验证正确后转化进入大肠杆菌BL21中获得表达重组菌。对重组菌诱导表达的两个条件IPTG浓度和温度进行优化，成功使Eno包涵体表达大量可溶表达。这对于利用价格低廉的生物柴油副产物甘油合成PHA，解决生物柴油副产物过度积累带来的环境问题，降低PHA的生产成本具有重要意义。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及利用PCR技术克隆恶臭假单胞菌中烯醇酶基因，导入大肠杆菌中构成重组菌，对其诱导表达条件进行优化，并测定酶活力，进而解决粗甘油耐受力比较弱的问题。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanonate，PHA)是很多微生物在碳源充足，氮源缺乏状态下产生的一类颗粒状、可作为生物体内碳源和能量储备物的高分子生物聚酯。由于PHA的优良性质，可以用在包装材料、医药行业和基因工程等。生物柴油的迅猛发展产生了大量的副产物，研究者在利用生物柴油副产物合成PHA时，发现一个问题，即微生物菌株对高浓度甘油耐受性较差，多数情况下，菌株在高浓度甘油条件下无法合成PHA，更不能直接利用生物柴油副产物合成PHA，当甘油的浓度的范围为1-5％时，为合成PHA的适宜浓度，这在一定程度上加大了PHA的生产成本。

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida KT2442)是一株来源于KT2440的线性聚酯类工业生产菌，通过发酵，细胞积累碳源和能量将糖类或者脂类转化为PHA。烯醇酶(Enolase，Eno)是一个抗逆性基因，带烯醇酶基因的菌株具有很强的抗逆性能力。研究表明，烯醇酶在厌氧、高盐、干旱、高温、低温等胁迫下会出现基因表达量的差异及酶活力的相应变化，从而为逆境下光合生物中被产生的大量自由基损伤的光合系统提供足够能量。

发明内容

本发明针对PHA在粗甘油中耐受力比较弱的问题，从恶臭假单胞菌中克隆抗逆性基因烯醇酶基因并将其导入筛选出来的耐受力比较好的菌株中构建重组菌，以提高重组菌对甘油的耐受力。这对于利用价格低廉的生物柴油副产物甘油合成PHA，解决生物柴油副产物过度积累带来的环境问题，降低PHA的生产成本具有重要意义。

本发明提供了一种利用PCR技术克隆烯醇酶基因导入大肠杆菌中构成重组菌，提高其对粗甘油的耐受力，进而降低PHA的生产成本。

本发明采用的技术方案是：一种恶臭假单胞菌烯醇酶基因克隆方法，包括如下步骤：

1)提取恶臭假单胞菌总DNA；

2)以提取的总DNA为模板，以上游引物P1和下游引物P2为特异性引物，通过PCR扩增获得目的片段；P1和P2的序列为：

P1：GATAAGCTTGTATGGCAAAAATCGTCG

P2：CATCTCGAGTTAGCCGCGAAACTC

3)将目的片段与表达载体pET28a经HindIII/XhoI双酶切，T4连接酶16℃过夜连接，获得重组质粒pET28a-eno；

4)将重组质粒pET28a-eno转化大肠杆菌感受态细胞中，获得重组菌；

5)将重组菌通过Kan抗性筛选阳性转化子；

6)挑取单菌落接种于含有Kan的培养液中培养过夜；按1-3％接种量转接于新鲜的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.5，加入终浓度为0.2-1mM的IPTG，于20-30℃培养4h；8000rpm离心，收集菌体。