[发明专利]海月水母水螅体的单细胞分离方法

权利要求书

1. 一种海月水母水螅体的单细胞分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、人工海水制备

配制盐度为2.8~3.0的人工海水，高温灭菌后，再次调整盐度；

B、水螅体样品准备

将海月水母水螅体从饲养缸内转移至盛有洁净无菌人工海水的培养容器内，并置于

20 ℃的培养箱中；将水螅体在使用前饥饿24 h，选取触手伸展的水螅体待用，并将样品切成一定尺寸的小块；所述样品选自不带芽体的海月水母水螅体整体，去除口腕、触手以及足部后的水螅体体干或带芽体的海月水母水螅体的芽体；

C、单细胞制备

配制浓度为30 g/L的氯化钠溶液作为解离液，而后以该解离液作为溶剂配制解离酶

液1或解离酶液2，

将样品小块加入至解离酶液1或解离酶液2中，37 ℃摇床、80~120 rpm消化5~10

min，获得消化混合液；混合液经25~35 μm细胞筛过滤，滤液经4 ℃，1200~1800 rpm离心7~12 min，沉淀采用解离液重复清洗后，复溶于解离液中得到单细胞悬液，

其中，所述解离酶液1包括0.01~1.5 g/L胶原酶I、0.01~1 g/L中性蛋白酶、0.01~0.5

g/L弹性蛋白酶；所述解离酶液2包括0.01~2 g/L胶原酶 IV以及0.01~20 U/mL木瓜蛋白酶；

当样品为不带芽体的海月水母水螅体整体时，采用解离酶液1或解离酶液2进行单

细胞分离；当样品为去除口腕、触手以及足部后的水螅体体干时，采用解离酶液1进行单细胞分离；当样品为带芽体的海月水母水螅体的芽体时，剔除死细胞并进行细胞量富集后采用解离酶液1进行单细胞分离。

2.根据权利要求1所述的海月水母水螅体的单细胞分离方法，其特征在于：

其中，步骤A中，采用蒸馏水和海水素配制人工海水，该人工海水的灭菌条件为120 ℃、5~10 min，灭菌后采用灭菌的蒸馏水再次调整盐度至2.8~3.2。

3.根据权利要求1所述的海月水母水螅体的单细胞分离方法，其特征在于：

其中，步骤B中，海月水母水螅体转移的步骤如下：

停止饲养缸内的海水循环和气泵，将缸内波纹板上的水螅体用吸管扣下，转移至盛有人工海水的培养皿内，去除基部附着的藻类后转移至盛有洁净、无菌人工海水的培养皿或六孔板中，六孔细胞培养板中每孔5 ~ 10只水螅体，培养皿内放入20 ~ 30只水螅体加盖，置于20 ℃的培养箱中。

4.根据权利要求1所述的海月水母水螅体的单细胞分离方法，其特征在于：

其中，步骤B中，样品被切成0.1×0.1×0.1cm³的小块。

5.根据权利要求1所述的海月水母水螅体的单细胞分离方法，其特征在于：

其中，步骤B中，如解离不能马上进行，将选取的水螅体样品放入美天旎组织保存液中，用锡纸包裹避光置于4 ℃冰箱中，同时保存时间不能超过48 h。

6.根据权利要求1所述的海月水母水螅体的单细胞分离方法，其特征在于：

其中，步骤C中，所述解离酶液1包括1 g/L胶原酶 I、0.5 g/L中性蛋白酶、0.3 g/L

弹性蛋白酶；

所述解离酶液2包括1 g/L胶原酶 IV以及20 U/mL木瓜蛋白酶。

7.根据权利要求1所述的海月水母水螅体的单细胞分离方法，其特征在于：

其中，步骤C中，获得消化混合液时，将样品小块加入至解离酶液1或解离酶液2

中，37 ℃摇床、100 rpm消化6 min；混合液经30 μm细胞筛过滤，滤液经4 ℃，1200~1800 rpm离心7~12 min，沉淀采用解离液重复清洗两次后，复溶于解离液中得到单细胞悬液。