[发明专利]系统在提高非天然氨基酸的插入效率中的应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，特别涉及系统在提高非天然氨基酸的插入效率中的应用。该系统可以将大肠杆菌翻译系统中终止因子(RF1、RF2、ArfB和Pth)都降解，产生不依赖密码子的翻译终止机制。该系统可以将大肠杆菌翻译系统中终止因子都降解，可以提高在目的蛋白中同时插入多个和多种非天然氨基酸酸的插入效率；在蛋白水平上，可以将大肠杆菌翻译系统中终止因子全部降解；将大肠杆菌翻译系统中终止因子都降解后，可以在TAG、TGA和TAA密码子插入非天然氨基酸，实现3个终止密码子的非天然氨基酸插入。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及系统在提高非天然氨基酸的插入效率中的应用。

背景技术

在自然中，20种天然氨基酸可产生结构功能多样的天然蛋白质，但随着生物技术的发展，原有的蛋白质已不能满足其在蛋白质药物生产、酶稳定性等方面的需求。研究发现生物的遗传密码在不同物种间也存在一定的差异性，例如酿酒酵母的线粒体中，终止密码子UGA也能编码色氨酸。在包括人类在内的许多物种中，UGA亦可被用于编码常规氨基之外的非天然氨基酸(Unnatural amino acids，UNAAs)，例如硒代半胱氨酸、磷酸丝氨酸、对乙酰苯丙氨酸等。这些UNAA可赋予蛋白质新的化学性质、结构及功能，打开了新蛋白质工程的大门，为生物研究、生物治疗学及合成生物学提供了新的途径。

有研究者利用密码子拓展技术将非天然氨基酸插入到抗体中，其核心是需要引入一套正交的外源翻译工具，即能特异性识别非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶以及能识别终止密码子的配对tRNA，构成氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对。同时，引入的正交系统不能与宿主细胞中的内源性氨酰-tRNA合成酶，也不能与宿主细胞中tRNA发生交叉反应。Axup等利用对乙酰苯丙氨酸(pAcF)氨酰tRNA合成酶/tRNA_UAG^pAcF正交分子对将对乙酰苯丙氨酸插入到抗体的可变区，制备一种偶联比约为2的抗体偶联药物。Ashok等利用aaRS/tRNA正交系统，将多巴(dopa)插入到乙醇脱氢酶II的活性中心，提高了酶的抗氧化能力。非天然蛋白最初主要在胞内合成，细胞不仅需要维持生长状态，以合成最高产量的目标蛋白，但由于细胞内代谢途径复杂，而含非天然氨基酸的蛋白在胞内的合成，通常导致产物产量低，且纯化步骤繁琐；同时大部分非天然氨基酸在不同程度上对细胞有毒且不易穿过细胞膜，降低了目标蛋白的含量，这些局限性限制了胞内合成非天然蛋白质的广泛应用。与此同时无细胞蛋白合成系统(Cell-free protein synthesis，CFPS)日益成熟，推动了非天然蛋白质的胞外合成的发展。无细胞非天然蛋白合成系统是一种以外源基因为模板，向细胞抽提物中添加底物、能量、辅因子、正交系统、NCAAs和酶等，在体外合成非天然蛋白质的系统，与胞内蛋白合成系统相比，该系统具有可控、周期短和系统稳定性高等优点。

目前将NCAAs插入CFPS中的主要方法是基于天然翻译体系的终止密码子抑制，其本质上是利用终止密码子来编码氨基酸，然而CFPS中NCAAs的引入受到了内源性释放因子(release factor，RF)的竞争，其主要识别终止密码子引起肽链和核糖体从mRNA上释放，从而抑制NCAAs的插入。在细胞内RF1是基因组中300多个基因翻译终止所必需的，直接删除prfA基因会严重影响细胞的生长，甚至导致细胞死亡。

目前有多种方法可以提高非天然氨基酸(Unnatural amino acids，UNAAs)在细菌中的插入效率，例如细菌裂解后，通过透析除去内源的氨基酸、内源性的tRNA，之后加入非天然氨基酸或者相应的tRNA，此方法在一定程度上增加了非天然氨基酸的插入效率，由于没有除去释放因子RF，仍然会一定程度上造成翻译的提前终止，产生截短的蛋白。通过工程化底盘细胞，将大肠杆菌基因组上密码子UGA全部替换为UAA，并将RF1敲除已达到提高非天然氨基酸在蛋白翻译过程中的插入效率，此方法虽然在源头上除去了释放因子RF1，但是细菌中的翻译过程中的终止因子不仅仅只有RF1。