[发明专利]一种新型B族链球菌核酸PCR-胶体金免疫层析法检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种新型B族链球菌核酸PCR‑胶体金免疫层析法检测试剂盒，该试剂盒包括扩增反应MIX、GBS检测液、阳性对照品、阴性对照品和样本释放剂；所述GBS检测液包括针对B族链球菌CAMP基因的特异性标记引物、内参基因RNAse P的特异性标记引物和RNase Free ddH₂O。本发明的新型B族链球菌核酸PCR‑胶体金免疫层析法检测试剂盒通过对采集的细胞样本经提取核酸后，在Taq DNA聚合酶的作用下，扩增出特异性片段，再利用胶体金免疫层析法实现B族链球菌核酸检测，另外，在样本的采集、核酸提取和PCR扩增过程中有内参基因RNAse P进行质控跟踪，保证全部实验过程均在可控范围内。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体来说，涉及一种新型B族链球菌核酸PCR-胶体金免疫层析法检测试剂盒。

背景技术

B族链球菌是一种革兰氏阳性球菌，学名无乳链球菌(S.agalactiae)，早期被兽医界重视是由于它能引起牛乳房炎，严重危害畜牧业。直至1938年，Fry首次报告3例人类感染B族链球菌引起产后心内膜炎的死亡，证实B族链球菌也是人类的致病菌。由于该菌细胞壁中多糖物质属于抗原构造分类中的B族，故又被称为B族链球菌(Group B Streptococcus，GBS)。

B族链球菌是一种条件致病菌，是国际上公认的新生儿侵袭性感染的首要原因。如果孕妇感染B族链球菌，新生儿就可能在出生时吸入感染的羊水或通过产道时感染B族链球菌。新生儿感染B族链球菌主要表现为早期侵入性感染，以新生儿败血症为主要临床表现。新生儿感染B族链球菌能够导致败血症，肺炎和脑膜炎，发病率和死亡率较高，也可能遗留长期病理状态如耳聋、视力受损、发育障碍以及脑瘫等。同时，B族链球菌还可引起早产、胎儿发育不良(低体重儿)、胎膜早破及晚期流产。美国新哈芬地区历经10年的调查统计结果显示：新生儿败血症年发生率为2.7‰，其中约50％是B族链球菌感染引起的。抗生素(尤其是青霉素)是治疗B族链球菌感染的有效手段，因此为避免抗生素滥用、同时又有效降低新生儿GBS感染，在孕妇产前进行B族链球菌感染筛检显得尤为必要。

为降低由于B族链球菌感染导致的新生儿感染，中华医学会妇产科学分会产科学组在《孕前和孕期保健指南建议》(2018版)中明确将GBS筛查作为高危孕妇的备查项目，且最佳检测时间在35～37周。因此，建立有效快捷的孕产妇GBS筛查方法，对于降低新生儿GBS感染具有重要意义。

目前B族链球菌感染的实验室检测方案主要包括传统的培养法和荧光定量PCR法。培养法作为病原微生物检测的金标准，具有特异性高的显著优势，但却具有耗时长、费用大、培养难度高、通量低、灵敏度低等一系列缺点，很难满足临床实际需求；荧光定量PCR法具有灵敏度高、耗时短、通量相对较高的优势，但其检测过程依赖于昂贵的qPCR仪器，又很难满足基层医院的需求。

核酸胶体金免疫层析技术是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上形成检测线(T线)、内参线(R线)和质控线(C线)，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上。待测样本通过常规的核酸提取后，采用5’端带有特定标记的引物进行PCR扩增，之后将扩增产物直接添加到试纸条一端的样本垫上后，扩增产物通过毛细作用向前移动，在结合垫上与胶体金标记试剂相互作用，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，形成肉眼可观察的显色结果(如图1所示)。该方法已广泛应用于抗原抗体检测，但在核酸检测领域还鲜有使用。

在整个实验过程中，需要经过样本核酸提取和PCR扩增，可能会出现污染或其他干扰因素，而传统胶体金只有两条检测线，无法设置内参基因检测，不能有效监控整个核酸检测过程，可能造成假阴性结果，干扰判断。

本发明旨在建立一种利用PCR技术和胶体金免疫层析技术的能够简便、快速、准确、高通量检测35～37周孕妇GBS感染情况的试剂盒。该试剂盒内有内参基因进行全程质控，可以避免假阴性结果干扰。

发明内容