[发明专利]一种isPLA-Seq的高通量检测蛋白质相互作用的方法和试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种鉴定与待研究蛋白发生相互作用的蛋白的方法，其特征在于，包括：

1)构建含有第一标签的cDNA文库的第一重组表达载体；

2)构建可表达含有第二标签的待研究蛋白的第二重组表达载体，所述第二标签与第一标签不同，所述第二重组表达载体的出发载体与第一重组表达载体的出发载体不同；

3)将第一重组表达载体和第二重组表达载体共转染细胞，培养一段时间后将细胞进行固定；

4)将步骤3)制备的固定后的细胞进行原位邻近连接实验isPLA，然后分选isPLA阳性细胞；

5)将步骤4)获得的isPLA阳性细胞裂解后作为PCR的模板，根据第一重组表达载体的外源基因插入位点的上下游序列设计引物进行PCR扩增，然后将PCR产物进行测序，以鉴定与待研究蛋白可能发生相互作用的蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括步骤6)，利用重组克隆技术将步骤5)获得的PCR产物构建含有第一标签的阳性cDNA亚文库，再重复步骤1)至5)，通过多轮筛选来逐步富集isPLA阳性细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述第一重组表达载体的出发载体是真核表达载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一重组表达载体的出发载体是pcDNA3.1。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一标签为Flag或HA。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述第二重组表达载体的出发载体是真核表达载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二重组表达载体的出发载体是pCMV-HA。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第二标签为HA或Flag。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤5)中，上下游引物分别为：5’-GCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3’和5’-TGACACCTACTCAGACAATGCGATGC-3’。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述共转染的细胞选自哺乳动物细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述共转染的细胞为HEK293T细胞。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述分选采用流式分析方法进行或采用激光切割捕获方法进行。

13.一种鉴定与待研究蛋白发生相互作用的蛋白的试剂盒，包括：第一重组表达载体、第二重组表达载体和PCR引物对；所述第一重组表达载体包括带第一标签的cDNA文库；所述第二重组表达载体可表达带第二标签的待研究蛋白；所述PCR引物对与第一重组表达载体的带第一标签的cDNA插入位点的上下游序列互补；所述第一标签和第二标签不同；所述第一重组表达载体的出发载体和第二重组表达载体的出发载体不同；所述试剂盒还包括用于原位邻近连接实验isPLA的试剂。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述第一重组表达载体的出发载体为pcDNA3.1，对应的PCR引物对的上下游引物分别为：5’-GCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3’和5’-TGACACCTACTCAGACAATGCGATGC-3’。