[发明专利]一种SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种SARS‑CoV‑2‑RBD真核蛋白表达载体及其制备方法和用途。其中真核蛋白表达载体为含有tPA信号肽的pcDNA3.1，信号肽序列后面连接SEQ ID NO:2所示的基因序列。本发明通过引入tPA信号肽，同时人工优化得到SEQ ID NO:2，使得SARS‑CoV‑2‑RBD在真核细胞中大量表达，并且可以分泌到293F细胞外。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体及其制备方法和用途。

背景技术

冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。2020年1月12日，世界卫生组织正式将其命名2019-nCoV。2019-nCoV有四种主要的结构蛋白：刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)，膜蛋白(Membrane protein，M蛋白)，包膜蛋白(Envelope protein，E蛋白)。感染过程中，S蛋白被宿主蛋白酶(如TMPRSS2)裂解为N端S1亚基和C端S2亚基，S1和S2分别介导受体结合和膜融合。其中，S1包含N末端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)，RBD是新冠病毒特异性所在，在病毒入侵人体时，RBD会与人类受体ACE2(血管紧张素转化酶2)结合。新冠病毒刺突蛋白S蛋白有两个亚基：S1和S2，受体结合位点(RBD)位于S1亚基上。RBD是引起宿主免疫反应和产生中和抗体的主要靶抗原，也是疫苗研发和病原检测的重要靶标，选用适宜的真核表达系统高效表达RBD蛋白是进行相关研究的基础。

蛋白质糖基化是生物体内最重要的翻译后修饰形式之一，可发生在细胞中50％-70％的蛋白质上。对于病毒，其自身结构蛋白的糖基化修饰与病毒生成、病毒感染和机体免疫应答均有密切关系。有研究表明，2019-nCoV的S蛋白存在22个糖基化位点。由于在2019-nCoV-RBD蛋白上存在糖基化位点，所以RBD蛋白的大量外源表达不适合通过原核表达系统，而是需要通过哺乳动物细胞真核表达系统。

信号肽(Signal peptide，SP)是引导细胞内新合成蛋白质转移到内质网进而分泌到细胞外的一段短肽，由15～30个氨基酸残基组成，通常位于新合成肽链的N端。由于信号肽序列在不同蛋白之间可以通用，筛选实用性广、可高效引导蛋白质分泌表达的信号肽序列是优化蛋白质外源表达的关键策略之一。高斯荧光素酶(Gaussia luciferase，GLuc)、组织纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，tPA)及小鼠免疫球蛋白G 2a亚型(mouse immunoglobular G subtype 2a，MIgG2a)的信号肽序列常用于真核系统中蛋白的分泌表达。

抗体是大多数疫苗必不可少的元素，可能会成为抗SARS-CoV-2的有效疫苗的关键组成部分。观察表明，大多数恢复期患者的血浆中和活性较低，但是在血浆中和活性异常的患者中可以发现具有有效中和活性的抗SARS-CoV-2RBD复发的抗体，这表明人类具有内在的能力产生抗RBD能有效中和SARS-CoV-2的抗体。因此，特异性和有效地诱导靶向SARS-CoV-2-RBD的抗体的疫苗可能是特别有效的。RBD是引起宿主免疫反应和产生中和抗体的主要靶抗原，也是疫苗研发和病原检测的重要靶标，选用适宜的真核表达系统高效表达RBD蛋白是进行相关研究的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在真核细胞中大量表达，并且可以分泌到293F细胞外的SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体。

为实现上述目的，本发明提供一种SARS-CoV-2-RBD真核蛋白表达载体，其特征在于，真核蛋白表达载体为含有tPA信号肽的pcDNA3.1，信号肽序列后面连接SEQ ID NO:2所示的基因序列。

进一步，其制备方法为，