[发明专利]一种抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂及其纯化方法和应用

权利要求书

1.一种抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂，其特征在于，所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂N端前10个氨基酸序列如SEQ NO：1所示；所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂氨基酸全序列如SEQNO：2所示；所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂DNA序列如SEQ NO：3所示。

2.一种权利要求1所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂的提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）僵蚕溶茧酶抑制剂的提取：白僵蚕粉碎后加入水煎煮，过滤除渣，滤液冷冻干燥，加入10倍体积的缓冲液，匀浆提取，离心收集上清液，沉淀物重复提取2次，合并上清液，冷冻干燥，得白僵蚕粗蛋白冻干粉；

（2）僵蚕溶茧酶抑制剂的硫酸铵分步盐析法分离：取步骤（1）中的白僵蚕冻干粉溶于缓冲液中，离心收集上清液，缓慢加入硫酸铵调节饱和度至25%，25℃下温和搅拌30min，离心收集沉淀物，得25%饱和度的硫酸铵沉淀，上清液重复以上操作，得55%、85%饱和度的硫酸铵沉淀，85%饱和度的硫酸铵沉淀物于4 ℃下透析36 h，离心，上清液冷冻干燥，得粗僵蚕溶茧酶抑制剂；

（3）僵蚕溶茧酶抑制剂的亲和色谱：选择家蚕溶茧酶作为亲和色谱的配体，将CNBr活化的Sepharose CL-4B与家蚕溶茧酶偶联，制成亲和载体，将步骤（2）中的粗僵蚕溶茧酶抑制剂溶于缓冲液中，4℃离心，上清液加样于亲和色谱柱，37℃保温1h，依次用含1.00mol·L^-1NaCl的平衡缓冲液、蒸馏水、pH2.4氯化氢溶液洗柱，收集洗脱液，用2.00 mol .L^-1Tris碱中和，重复加样，合并Tris碱中和液，透析，冻干，获得基本纯化的僵蚕溶茧酶抑制剂；

（4）僵蚕溶茧酶抑制剂的凝胶过滤色谱：将步骤（3）中基本纯化的僵蚕溶茧酶抑制剂溶于缓冲液中，加样于Sephadex G-50凝胶过滤色谱柱，流速1.00 mL .min^-1，检测各洗脱峰的溶茧酶抑制活性，收集具有溶茧酶抑制活性的蛋白峰组分，收集液经透析和冻干后，获得更高纯度的僵蚕溶茧酶抑制剂；

（5）僵蚕溶茧酶抑制剂的快速蛋白质液相色谱：步骤（4）中更高纯度的僵蚕溶茧酶抑制剂

进一步做Superdex 75 Increase 10/300 G L FPLC分离，用2倍体积的缓冲液平衡色谱柱上样后收集1.2倍柱体积的洗脱液，每管1 mL，流速0 .50mL·min-1，检测各洗脱峰溶茧酶抑制活性，收集具有溶茧酶抑制活性的蛋白峰，收集液经透析和冻干后，获得高度纯化的僵蚕溶茧酶抑制剂；

步骤（3）中所述的家蚕溶茧酶是家蚕蛹羽化成蛾后由蚕蛾的下颚合成分泌的一种丝氨酸蛋白酶；

所述的缓冲溶液为50.00 mmol·L^-1，pH 8.0，Tris-HCl缓冲液。

3.一种权利要求1所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂在制备丝氨酸蛋白酶抑制剂中的应用。

4.一种权利要求1所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂在制备抗肝癌药物中的应用。