[发明专利]一种检测禾谷镰孢菌的引物探针组合物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及一种检测禾谷镰孢菌的引物探针组合物、试剂盒及检测方法。所述引物探针组合物包括检测禾谷镰孢菌的半乳糖氧化酶前体物基因1～500bp序列的正向引物、反向引物和探针。所述引物探针组合物具备较高的特异性和灵敏度，能够实现对禾谷镰孢菌的半乳糖氧化酶基因的特异性扩增，且具备高灵敏度；所述检测方法既具备高特异性和灵敏度，又便于操作，能很好地满足对禾谷镰孢菌进行现场检测的要求。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测禾谷镰孢菌的引物探针组合物、试剂盒及检测方法。

背景技术

玉米是全球也是中国第一大作物，2019年我国玉米产量为26077万吨，占粮食总产量的39.28％。由禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)引起的玉米穗腐病(maize earrot)是玉米的主要穗部病害，不仅降低玉米产量，而且影响种子品质。除此之外，禾谷镰孢菌还能产生多种有毒的次生代谢产物(单端孢霉烯族化合物)，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)等。DON能引起动物的呕吐，且对人体有一定的危害作用，被国际癌症研究机构认定为三类致癌物。因此，检测饲用玉米中的禾谷镰孢菌对保护人畜安全至关重要。

传统的镰孢菌分类鉴定主要基于形态学特征，根据菌落形态、分生孢子、分生孢子梗和分生孢子座等进行区分与鉴定，其在禾谷镰孢菌检测中发挥了重要作用，然而这种方法费时费力，要求操作者具备专业的镰孢菌形态学鉴定知识和丰富的实际经验；随着分子技术的发展，聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR(real-time PCR)已成功应用于禾谷镰孢菌的检测，但其检测周期较长，且依赖于PCR仪等精密仪器，不能满足快速检测的需求。

环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法能够实现禾谷镰孢菌的快速检测。

CN104313128A公开了一种基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法及引物组合物，所述的引物组合物在检测大豆禾谷镰孢菌中的应用，检测体系在62℃等温条件下，能高效、高特异、高灵敏地检测到大豆禾谷镰孢菌，但是反应需要在高温下进行，需要水浴锅或其它设备进行辅助。

综上所述，建立一种更低的反应温度和更精简的仪器要求的检测方法，对于快速检测禾谷镰孢菌的方法开发领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测禾谷镰孢菌的引物探针组合物、试剂盒及检测方法，所述检测方法具备高特异性和灵敏度，且操作简便快捷，满足对禾谷镰孢菌进行现场检测的要求，可用于田间禾谷镰孢菌的早期诊断和病害监测。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测禾谷镰孢菌(F.graminearum)的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括检测禾谷镰孢菌的半乳糖氧化酶前体基因1～500bp序列的正向引物、反向引物和探针。

本发明中的引物和探针具备较高的特异性和灵敏度，能够实现对禾谷镰孢菌的半乳糖氧化酶前体基因的特异性扩增，且具备高灵敏度。

优选地，所述正向引物包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

优选地，所述反向引物包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

优选地，所述探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

优选地，所述反向引物的5’端修饰有生物素(Biotin)。

优选地，所述探针的5’端修饰有荧光基团。

优选地，所述荧光基团包括FAM。

优选地，所述探针的3’端修饰有间臂。

优选地，所述间臂包括C3-spacer。