[发明专利]一种携带Klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法及其应用

权利要求书

1.一种携带Klotho启动基因的重组腺病毒，其特征在于：通过将Klotho启动基因插入含有腺病毒基因组的腺病毒穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP中获得；

构建所述重组腺病毒所用的穿梭质粒为pAdTrack-CMV；

构建所述重组腺病毒所用的病毒骨架质粒为pAdeasy-1；

构建所述重组腺病毒所用的包装细胞为人胚肾293A细胞。

2.一种根据权利要求1所述的一种携带Klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、目的基因Klotho启动基因的获取：提取Klotho启动基因的总mRNA，逆转录合成cDNA模板，使用Primer5.0软件设计针对Klotho启动基因全长的特异性引物，在上游引物加入BamHI酶切位点及Kozak序列，在下游引物加入HindIII酶切位点，上游引物和下游引物分别符合SEQID2SEQID3的核苷酸序列；

SEQID2AGAGGATCCACCACCATGGCCACCAATAAGGAG，

SEQID3ATCAAGCTTTCAGGGGCCCTGGTCAGGTTGG；

S1.1、用2×PfuPCRMasterMix进行体外Touch-DownPCR扩增获得目的基因RARγ，符合SEQID1的核苷酸序列；

S2、Klotho启动基因片段的获得与重组穿梭质粒的构建；

S2.1、采用无缝克隆技术将Klotho启动基因插入穿梭质粒载体载体pAdtrace-TOX中，得到克隆载体pUC57-PLCγ2；

S2.2、以克隆载体pUC57-PLCγ2为模板，以ForwardprimerRewardprimer为引物，PCR扩增，凝胶回收扩增产物PLCγ2，并利用SmaI将扩增产物PLCγ2酶切，凝胶回收得到PLCγ2酶切产物；

S2.3、以SmaI酶切腺病毒穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP，对酶切后的产物进行凝胶回收和纯化，得到MCMV酶切产物；

S2.4、利用DNAT4连接酶将PLCγ2酶切产物和MCMV酶切产物连接，得到重组穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP-PLCγ2。

3.根据权利要求2所述的一种携带Klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法，其特征在于：根据步骤S1.2所述：

Forwardprimer的序列为：

5’-CTGCAGGTCGGATCCAGACCCGGGATGACCACCATGGTCAACGTGGA-3’；

Rewardprimer的序列为：

5’-TCTGTAGAATTCGGTCCCGGGGGAGTAGAACCTGCTGTTACTCA-3’。

4.根据权利要求2所述的一种携带Klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法，其特征在于：根据权利要求2所述的细胞构建方法还包括以下步骤：

S3重组Klotho启动基因的构建；

S3.1、将HEK293细胞接种于含10％FBS的DMEM完全培养液中，于5％CO2、37℃环境中培养，当细胞密度达到70-80％时，将重组穿梭质粒pHBAd-MCMV-GFP-PLCγ2和腺病毒骨架载体pHBAd-BHG经转染试剂LipofiterTM介导，共转染HEK293细胞，得到细胞混合物；

S3.2、将所述细胞混合物接种于含10％FBS的DMEM完全培养液中，按“8”字形晃动，5％CO2、37℃条件下培养，6h后更换新鲜的DMEM完全培养液，观察细胞出毒情况，当细胞渐成葡萄状并出现噬斑时，将从培养皿底部脱落的细胞收集至离心管中，离心管交替置于液氮和37℃水浴条件下进行冻融，然后离心，收集上清毒液，即得到第一代毒种P1；

S3.3、用第一代毒种P1感染密度为90％的HEK293细胞，收集第二代毒种P2；

S3.4、用第二代毒种P2感染密度为90％的HEK293细胞，收集第三代毒种P3，所述第三代毒种P3即为携带Klotho启动基因重组腺病毒。