[发明专利]一种布鲁氏菌外膜囊泡的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种布鲁氏菌外膜囊泡的制备方法及其应用，涉及生物技术领域。所述方法包括以基因OMP39、BamD、OMP2b、Cgs、BF3285c中的一种或多种为靶标进行改造获得基因缺失突变株的步骤。本发明通过基因工程方法，选择潜在的基因靶标位点进行改造，成功获得5株基因缺失菌株，进行菌株培养提取外膜囊泡的结果显示改造后的菌株外膜囊泡产量得到显著提高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种布鲁氏菌外膜囊泡的制备方法及其应用。

背景技术

布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患传染病，人感染后出现发热、肌肉酸疼等症状，之后逐步丧失劳动力。动物感染后主要引起繁殖障碍。总之，布鲁氏菌病会对社会和经济发展造成重大的影响。过去的几十年中，通过疫苗免疫和防控宣传，使大家对布鲁氏菌病有了更充分的了解，但要更一步的提高防控效果以及根除布鲁氏菌仍有更多的工作要做，最主要的是研发安全有效的疫苗，当前使用的疫苗主要为减毒活疫苗，在疫苗的使用过程中对人和动物存在感染的风险，成为疫苗推广使用的主要痛点。

革兰氏阴性菌的外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMVs)具有双层膜，由脂蛋白、外膜蛋白(OMP)、脂多糖(LPS)和一些周质成分组成，含有菌体必须的免疫原性蛋白，同时含有大量的病原相关模式分子(PAMP)，能有效诱导机体的非特异性免疫。因此，外膜囊泡可用于研发布鲁氏菌疫苗或者用于增强免疫性。然而，由布鲁氏菌正常分泌产生的外膜囊泡的量相对较少，因此，有必要提供一种能够提高布鲁氏菌外膜囊泡产量的制备方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种布鲁氏菌外膜囊泡的制备方法及其应用，以解决现有技术中存在的布鲁氏菌外膜囊泡产量不高的技术问题。

本发明提供的技术方案如下：

在一方面，本发明提供了一种布鲁氏菌外膜囊泡的制备方法，所述方法包括以基因BamD、OMP39、OMP2b、Cgs、BF3285c中的一种或多种为靶标进行改造获得基因缺失突变株的步骤。

本发明提供的外膜囊泡制备方法，通过基因工程方法选择细胞膜稳定性相关的基因靶标位点进行改造，成功获得5株基因缺失菌株，利用所述基因缺失突变株提取外膜囊泡，3株显著提高了菌株外膜囊泡产量。

在一个实施方案中，所述改造获得基因缺失突变株采用同源重组的方法进行；优选地，所述同源重组为自杀性质粒介导的同源重组。

在一个实施方案中，所述改造获得基因缺失突变株包括以下步骤：

(a)扩增待敲除基因的上下游同源臂；

(b)将扩增产物DNA片段分别连接果糖蔗糖酶基因SacB，然后构建自杀性质粒；

(c)将所述自杀性质粒加入布鲁氏菌感受态细胞中并进行转化；

(d)筛选阳性克隆株。

在一个实施方案中，所述自杀性质粒为pBK-CMV-ΔBamD-SacB、pBK-CMV-ΔOMP39-SacB、pBK-CMV-Δomp2b-SacB、pBK-CMV-Δcgs-SacB、pBK-CMV-ΔBF3285c-SacB。

在一个实施方案中，当所述待敲除基因为BamD时，扩增上游同源臂序列的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；扩增下游同源臂序列的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

当所述待敲除基因为OMP39时，扩增上游同源臂序列的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；扩增下游同源臂序列的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；