[发明专利]一种罗汉果蛋白酶的分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种罗汉果蛋白酶的分离纯化方法，包括以下步骤：S1.获取新鲜罗汉果的鲜果汁，用D101大孔树脂柱分离，得粗酶汁；S2.采用冷冻干燥法或硫酸铵分级沉淀法纯化，得罗汉果蛋白酶或罗汉果蛋白酶液能很好的将罗汉果汁中的罗汉果蛋白酶与罗汉果甜苷V分离，且能较好的保留罗汉果蛋白酶的活性。

技术领域

本发明涉及罗汉果提取技术领域，尤其是一种罗汉果蛋白酶的分离纯化方法。

背景技术

罗汉果属植物的成熟果实，为葫芦科植物罗汉果的果实，秋季果实由嫩绿色变深绿色时采收。常生于山坡林下及河边湿地、灌木丛中，分布于江西、湖南、广东、广西、贵州等地。其营养价值很高，含丰富的维生素C及糖苷、果糖、葡萄糖、蛋白质和脂类等。

罗汉果为卫生部首批公布的药食两用名贵中药材，其所含罗汉果甜甙比蔗糖甜300倍，不产生热量，是饮料、糖果行业的名贵原料，是蔗糖的最佳替代品。罗汉果营养价值高，有清热、润肺、止咳、化痰、益肝、健脾和提神生津等功效；现代医学证明，罗汉果对支气管炎、高血压、咽喉炎、支气管哮喘、百日咳、胃热、便秘、急性扁桃体炎等疾病有显著疗效，还能起到防治冠心病、血管硬化、肥胖症的作用。

罗汉果除了被广泛用于医药外，还主要用于生产罗汉果甜苷，罗汉果甜苷是一种低热型甜味剂，是罗汉果中主要的有效成分，由于近年来罗汉果甜苷广泛应用于饮料和食品产品，从而使罗汉果行业得到了快速发展，而罗汉果甜苷中的主要成分是罗汉果甜苷V。在实际生产中也是用罗汉果甜苷V含量来衡量罗汉果甜苷的质量。另外，新鲜罗汉果中含有对酪蛋白高水解活性的蛋白酶。相同条件下， 罗汉果蛋白酶的活性是木瓜蛋白酶活性的10 倍以上，所以罗汉果蛋白酶具有较高的研究开发价值。

至今已报道的罗汉果蛋白酶分离方法有硫酸铵盐析法和超滤膜分离法等。在实际应用这些方法时，由于受到罗汉果中甜苷的沾粘性质的影响，使分离罗汉果蛋白酶的过程变得困难，且分离得到的蛋白酶难以完全除去罗汉果甜苷，而使得到蛋白酶中含有甜味，不利于该酶在食品中的应用。

因此，除去罗汉果汁中的罗汉果甜苷，将罗汉果蛋白酶和罗汉果皂苷分离，对罗汉果蛋白酶的开发具有重要意义。

发明内容

本发明公开了一种罗汉果蛋白酶的分离纯化方法，能很好的将罗汉果汁中的罗汉果蛋白酶与罗汉果甜苷V分离，且能较好的保留 罗汉果蛋白酶的活性。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种罗汉果蛋白酶的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1.获取新鲜罗汉果的鲜果汁，经D101大孔树脂柱分离，收集流出的无甜味的分离酶汁，待酶汁完全流出后，用水冲洗D101大孔树脂柱，得冲洗液，合并冲洗液和分离酶汁，得粗酶汁；

S2.采用冷冻干燥法或硫酸铵分级沉淀法纯化，得罗汉果蛋白酶或罗汉果蛋白酶液。

进一步的，新鲜罗汉果的鲜果汁的获取方法选自以下方法中的一种：

（1）新鲜罗汉果榨汁，或通过离心脱水机离心，得到一级果汁，再使用水多次浸泡果渣，得浸泡液，合并浸泡液和一级果汁，得鲜果汁；

（2）新鲜罗汉果捣碎或压烂，用水多次浸泡，得浸泡液，浸泡液过滤或离心，弃去果渣，得鲜果汁。

进一步的，所述步骤S2中，所述冷冻干燥法具体为：温度≤-50℃，真空度≤10Pa。

进一步的，所述步骤S2中，所述硫酸铵分级沉淀法具体为：将粗酶汁加入固体硫酸铵使其饱和度为50~100%，静置，冷冻离心，沉淀用0.03~0.06mol/L、pH为6.5~7.5、含有0.5~1.5mmol/L EDTA的Tris-HCl缓冲液溶解，再用溶解沉淀后的Tris-HCl缓冲液透析至用 1 %的 BaCl₂ 溶液检测不到沉淀，然后冷冻离心，取上清液，得罗汉果蛋白酶液。