[发明专利]一种生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO及其制备方法有效
| 申请号： | 202110286330.1 | 申请日： | 2021-03-17 |
| 公开（公告）号： | CN113215103B | 公开（公告）日： | 2023-03-31 |
| 发明（设计）人： | 藤田盛久;冷继雄;高晓冬;杨刚龙;柳艺石;任伟伟 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/85;C12N15/12;C12N15/11 |
| 代理公司： | 南京禹为知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 32272 | 代理人： | 刘峰 |
| 地址： | 214122 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 生产 杂合型 修饰 糖蛋白 细胞株 dfko 及其 制备 方法 | ||
1.一种生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO的制备方法，其特征在于：利用CRISPR-Cas9敲除系统，敲除或破坏HEK293细胞的N糖基化路径的基因，获得敲除N糖基化路径基因的细胞株DFKO；
其中，所述N糖基化路径的基因为MAN2A1、MAN2A2和FUT8；
所述敲除或破坏细胞的N糖基化路径的基因，其为先敲除MAN2A1和MAN2A2基因再敲除FUT8基因。
2.如权利要求1所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO的制备方法，其特征在于：所述敲除或破坏，其为将guide-RNA的DNA序列连接到所述CRISPR-Cas9敲除系统的PX330-EGFP质粒中，再转染于HEK293细胞中，EGFP阳性细胞株经筛选富集、有限稀释，得到DFKO细胞株。
3.如权利要求2所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO的制备方法，其特征在于：所述guide-RNA的DNA序列包括序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:20。
4.如权利要求2所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO的制备方法，其特征在于：所述转染，其使用的转染试剂包括PEI-MAX、OPTI中的一种或几种。
5.如权利要求4所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO的制备方法，其特征在于：所述转染，其包括以下步骤，
将PEI-MAX与OPTI混合稀释，体积比为1：50，获得第一混合液，静置5~10分钟；
将PX330-EGFP质粒稀释于OPTI中，质粒使用量与OPTI比例为4ng：250μl，获得第二混合液，静置5~10分钟；
混匀所述第一混合液和所述第二混合液，静置15~30分钟；
均匀加到HEK293细胞中。
6.一种生产杂合型N糖链修饰糖蛋白的细胞株DFKO，其特征在于：所述细胞株为MAN2A1/A2/FUT8基因三敲除细胞株人胚肾细胞293-MAN2A1A2FUT8-DFKO，于2020年7月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国·武汉·武汉大学，保藏编号为CCTCC No.C2020123。
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