[发明专利]一种烟草生殖细胞特异高表达基因及应用

说明书

本发明涉及一种烟草生殖细胞特异高表达基因及应用，核苷酸序列如SEQ I D NO.1所示。本发明通过基因组信息学分析，鉴定获得栽培烟草该基因的编码序列及其启动子序列。通过候选启动子序列元件分析及基因表达谱分析，证实该基因是一个生殖细胞高丰度表达的基因。克隆获得该基因的启动子序列，并以其为启动元件构建生殖细胞特异高丰度表达Cas 9蛋白的基因编辑载体，将载体转入农杆菌，通过叶盘转化法获得转基因烟草植株，通过基因编辑靶位点测序分析发现，转基因烟草植株PDS基因突变效率高，研究结果对于构建高效率的植物基因失活载体并获得突变植株具有重要的指导意义及应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种烟草生殖生殖细胞特异高表达基 因及应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统的原理是通过由crRNA与tracrRNA形成的sgRNA (single-guideRNA，sgRNA)识别靶位点，并引导Cas9对靶基因进行定向剪 切，Cas9是由HNH和RuvC两个结构域组成，两个结构域分别负责切割DNA的 两条链，形成DNA双链断裂(double-strandbreak，DSB)。而DSB主要通过 两种方法进行修复。一种是非同源末端连接(NonhomologousEnd Joining， NHEJ)，这种修复方式会引起碱基的插入和缺失从而导致基因功能缺失。当有 供体DNA模板存在时，同源重组(Homologous recombination，HR)的精确修 复方式就会发生，但其效率较低。CRISPR/Cas9基因编辑系统设计简单，操作 容易，成本较低，得到了科研人员和实验室的“追捧”，因此，CRISPR/Cas9 系统也得到了很好的推广和发展。在2013年CRISPR/Cas9基因编辑体系率先 成功在水稻、拟南芥、烟草和小麦原生质体和农杆菌介导的Cas9-sgRNA共骨 架载体稳定转化。随后在马铃、大豆、玉米、大麦等植物中进行了该体系的应 用，并且在拟南芥、水稻、烟草中还实现了多基因的同时编辑。

CRISPR/Cas9系统在植物中通常是利用农杆菌介导的遗传转化使其整合 到基因组中发挥作用，构建的植物基因编辑载体通常利用花椰菜花叶病毒的 35S启动子启动表达Cas9。已有的研究结果显示，这种常规的基因编辑载体， 获得的后代编辑效率低。2015年，研究人员发现利用拟南芥中的YAO基因启 动子驱动Cas9，T2代的转基因拟南芥突变效率达到40.9％-85.7％，并且在T2 代中出现了靶标基因发生突变但没有Cas9嵌入的植株。在同一年，研究人员 利用拟南芥中的卵母细胞特异性基因EC1.2的启动子驱动Cas9，称为EPC(the egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 system)系统，高效 的获得了多个目标基因的非嵌合T1代突变体。

作为重要的经济作物和模式植物之一的烟草(Nicotiana tabacum)，有着 重要的研究价值。但是由于栽培烟草是异源四倍体且基因组庞大复杂，在利用 常规CRISPR/Cas9基因编辑载体进行编辑时，后代植株出现嵌合的比例较高且 基因编辑效率低，在应用过程中耗费大量的人力、物力、财力。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟草生殖细胞特异表达基因及应用，以解决现有 的利用常规35S为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑载体进行编辑时，后代植株 出现嵌合的比例较高且编辑效率低，耗费大量的人力、物力、财力的问题。

本发明通过构建烟草基因编辑载体时，以生殖细胞特异高表达NtEC1.2-1 基因启动子驱动Cas9蛋白表达，，实现降低烟草嵌合体的比率，提高基因编辑 效率的目的。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种烟草生殖细胞特异高表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 包括372个碱基，来源于烟草，命名为NtEC1.2-1。

优选的，所述烟草生殖细胞特异高表达基因的启动子，核苷酸序列如 SEQ IDNO.2所示，包括2186个碱基。