[发明专利]一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系及催化合成方法

权利要求书

1.一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系，其特征在于，所述催化合成体系包括：合成原料L-色氨酸和/或L-色氨酸衍生物、L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶、细胞色素P450酶、单加氧酶、辅因子和缓冲液；

其中，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB，且所述单加氧酶为SpcC。

2.根据权利要求1所述的催化合成体系，其特征在于，所述细胞色素P450酶包括StaP或RebP；

优选地，所述催化合成体系中，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB，所述细胞色素P450酶为RebP，且所述单加氧酶为SpcC。

3.根据权利要求1或2所述的催化合成体系，其特征在于，所述辅因子包括还原型辅酶和/或蛋白类辅因子；

优选地，所述还原型辅酶包括NADH和/或NADPH；

优选地，所述蛋白类辅因子包括FldA和/或FnR；

优选地，所述催化合成体系中包括辅因子NADPH、FldA和FnR。

4.根据权利要求1～3任一项所述的催化合成体系，其特征在于，所述催化合成体系中，L-色氨酸氧化酶液的总蛋白质量浓度为2～10mg/mL，优选为4～8mg/mL；

优选地，所述催化合成体系中，CPA合成酶液的总蛋白质量浓度为1～8mg/mL，优选为4～6mg/mL；

优选地，所述催化合成体系中，细胞色素P450酶液的总蛋白质量浓度为10～20mg/mL，优选为14～16mg/mL；

优选地，所述催化合成体系中，单加氧酶液的总蛋白质量浓度为30～40mg/mL，优选为33～36mg/mL；

优选地，所述催化合成体系中，所述辅因子NADPH的摩尔浓度为5～15mM，优选为8～12mM；

优选地，所述催化合成体系中，辅因子FldA蛋白液的总蛋白质量浓度为2～6mg/mL，优选为3～5mg/mL；

优选地，所述催化合成体系中，辅因子FnR蛋白液的总蛋白质量浓度为0.5～1.5mg/mL，优选为0.8～1mg/mL。

5.根据权利要求1～4任一项所述的催化合成体系，其特征在于，所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液；

优选地，所述Tris-HCl缓冲液的摩尔浓度为50～200mM；

优选地，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为6.8～7.2；

优选地，所述Tris-HCl缓冲液还包括氯化钠；

优选地，所述Tris-HCl缓冲液中氯化钠的摩尔浓度为100～200mM；

优选地，所述缓冲液还包括DTT；

优选地，所述缓冲液中DTT的摩尔浓度为0.5～1.5mM；

优选地，所述缓冲液还包括DMSO；

优选地，所述缓冲液中DMSO的质量浓度为5～15％。

6.一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成方法，其特征在于，所述催化合成方法包括：

分别构建表达L-色氨酸氧化酶VioA、CPA合成酶VioB、细胞色素P450酶和单加氧酶的载体，诱导表达并制备酶液；

将合成原料L-色氨酸和/或L-色氨酸衍生物、L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶、细胞色素P450酶、单加氧酶以及辅因子混合，得到如权利要求1～5任一项所述的催化合成体系，经反应，得到星孢菌素中间体K252c和/或K252c衍生物。

7.根据权利要求6所述的催化合成方法，其特征在于，所述反应的时间为8～20h；

优选地，所述反应的温度为20～37℃，优选为25℃。

8.根据权利要求6或7所述的催化合成方法，其特征在于，所述催化合成体系中细胞色素P450酶为RebP，所述单加氧酶为SpcC，所述辅因子为NADPH、FldA和FnR；

优选地，所述载体包括大肠杆菌表达载体；

优选地，所述载体包括表达载体pET-30a(+)。