[发明专利]一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法

说明书

本发明公开了一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法，在脱羧酶催化脱羧反应的体系中，添加碳酸酐酶捕获脱羧反应释放的二氧化碳原位调节脱羧过程的pH。本发明的利用碳酸苷酶原位利用催化反应中释放的二氧化碳调节L‑赖氨酸脱羧酶催化合成戊二胺过程的pH，通过对两种酶的配比，所形成的混合催化剂能够有效的稳定戊二胺合成过程中的pH，L‑赖氨酸脱羧酶的催化活性提高2倍，催300g/L L‑赖氨酸溶液催化0.5h可消耗250g/L L‑赖氨酸，催化结束pH为7.7。可以看出碳酸苷酶的添加能够快速促进二氧化碳溶解，缓解反应过程中的pH剧烈变化，有效的稳定脱羧酶催化过程的pH，维持了L‑赖氨酸脱酶的活性。

技术领域

本发明属于化学领域，具体涉及一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法。

背景技术

面对全球变暖得严峻挑战，可再生的生物资源代替不可再生的石油资源将继续造福人类。聚酰胺，又称尼龙，全球产量已经达到600万吨左右，需求量还在逐年增长。生物基聚酰胺研发已经成为全球关注热点。戊二胺，又称尸胺，是一种重要的工业平台化合物，可以与二元酸聚合成聚酰胺，例如PA56，PA510，PA54等，可广泛的应用于材料行业。目前，戊二胺的生产方法有两种，一种是通过基因工程菌发酵生产戊二胺，另外一种是以赖氨酸为原料，以赖氨酸脱羧酶为催化剂催化脱羧生产戊二胺。在催化L-赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸反应过程中，会释放脱去羧基释放二氧化碳，并且同时会消耗溶液中的质子。因此，在生产过程中，随着戊二胺浓度的增加，反应体系的pH值显著升高，赖氨酸脱羧酶随着pH升高，赖氨酸脱羧酶的十聚体结构会快速解聚，从而降低了酶的活性。在实际生产中，为了维持细胞的活性和稳定性，需要加入大量的强酸或缓冲盐，以控制最适pH(6.0-6.8)；然而，这样做会增加设备投资和环境负担。催化过程中，虽然伴随着酸性气体二氧化碳的释放，但是二氧化碳在溶液中的溶解度十分有限，大量二氧化碳气体被释放在空气中。在前期的研究工作中，将释放的二氧化碳通过封闭反应器加压的方式提高二氧化碳的溶解度，稳定的控制催化过程的pH，实现高效的脱羧催化过程。提高二氧化碳的溶解度是有利于脱羧的催化过程。但是该过程加压对设备要求高，且在完成催化恢复常压的过程中二氧化碳会被二次释放。因此，本发明旨在提供一种自调节该体系pH的方法，以有效解决上述技术问题。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法，即在脱羧酶催化脱羧反应的体系中，添加碳酸酐酶捕获脱羧反应释放的二氧化碳原位调节脱羧过程的pH。

其中，所述脱羧酶包括但不限于L-赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸酸脱羧酶、精氨酸酸脱羧酶、谷氨酸酸脱羧酶和组氨酸酸脱羧酶。

其中，所述L-赖氨酸脱羧酶为市场上直接购买所得，或按照如下步骤制备得到：

(i)将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的基因片段与载体pETdute-1酶切，酶切产物经回收纯化，连接，得到重组质粒pETdute-CadA；

(ii)将重组质粒pETdute-CadA导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌；

(iii)挑选重组菌的单克隆，培养后，收集菌液，离心，收集沉淀；

(iv)将沉淀重悬于缓冲液，超声裂解，离心，收集上清液，上清液即为L-赖氨酸脱羧酶的粗酶液。

步骤(i)中，所述酶切为将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的基因片段与载体pETdute-1用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切。

步骤(i)中，所述连接为用T₄DNA连接酶连接纯化的酶切产物。

步骤(iii)中，所述培养为摇床过夜培养后，再加入诱导剂诱导培养。