[发明专利]一种将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法

说明书

本发明提供的一种将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法，包括以下步骤：从外周血中获取PBMC；采用无血清培养基将PBMC的密度调整为0.9×10⁶～1.4×10⁶cells/ml，吹打均匀接种到预包被细胞接种瓶中；然后向预包被细胞接种瓶中加入IFN‑γ，扩增第0天，将预包被细胞接种瓶放入培养箱中诱导刺激24h；扩增第1天，向预包被细胞接种瓶中加入IL‑2，至IL‑2的浓度为700U/ml；扩增第4天，加入新鲜X‑VIVO15无血清培养基，同时加入IL‑2和NaHCO₃，至预包被细胞接种瓶中IL‑2的浓度为1000U/ml、NaHCO₃的浓度为1.97g/ml；维持预包被细胞接种瓶中的PH值为7.35～7.45；然后用地西他滨活化CD8+T细胞群即可；本发明具有工艺简单、成本低，安全性好的优点，具有将体外富集的PBMC定向、高效的扩增活化为CD8+T细胞群的有益效果，适用于PBMC扩增活化的领域。

技术领域

本发明涉及PBMC扩增活化的技术领域，具体涉及一种将体外富集的PBMC扩增活化CD8+T细胞群的方法。

背景技术

PBMC(外周血单个核细胞)，是指来源于外周血中的、具有单个核的白细胞。单个核细胞以淋巴细胞为主，包括少数单核细胞、浆细胞等。单个核细胞可以通过淋巴细胞分离液Ficoll-hypaque(聚蔗糖－泛影葡胺)密度梯度离心法或者6％羟乙基淀粉沉降法，从外周血中分离获得。

T细胞，又名T淋巴细胞，由一群功能不同的异质性淋巴细胞组成，其成分不均一、又不断在体内更新，在同一时间可以存在不同发育阶段或功能的亚群，分类原则和命名比较混乱，尚未统一。按照功能和表面标志可以分成辅助/抑制T细胞(CD4+)、细胞毒T细胞(CD8+)、自然杀伤性T细胞(CD3+CD56+)和记忆T细胞(Tcm)等组分。根据CD3、CD4、CD8、CD56等4个表型标志可以区分上述细胞亚群和组分。

CD8+T细胞又称细胞毒T淋巴细胞(CTL)。是发挥抗病毒、抗肿瘤最主要的一种特异T细胞。CD8+T细胞通过T细胞受体(TCR)特异性识别抗原，通过Fasl介导靶细胞的凋亡和释放各种细胞因子(例穿孔素，颗粒酶)杀伤靶细胞，参与免疫作用。是适应性免疫系统构建抗原特异性免疫保护机制的一条重要防线。

当前，在肿瘤免疫医学领域，各生物公司、三甲医院和科研院所等通过从人体外周血中分离富集单个核细胞，利用细胞工程、基因编辑等技术诱导、改造T细胞，并规模化扩增，然后静脉输注给患者进行抗病毒抗肿瘤的治疗，这种治疗选项称为过继性T细胞治疗。例如DC-CIK细胞技术、CAR-T细胞技术、TCR-T细胞技术。临床资料揭示，这种T细胞治疗可以使难治性的病毒感染(如CMV和EB病毒等)和恶性肿瘤(如黑色素瘤等)得到控制，取得明显的临床疗效。这种新颖的T细胞治疗被誉为是引领肿瘤治疗发展的一个前沿领域，受到了肿瘤医药界的高度关注。

然而，不管是一代LAK细胞、二代DC-CIK细胞还是三代CAR-T、TCR-T细胞技术，都是以高质量、高活性的CD8+T细胞为基础。除去以磁珠分选从外周血中获得高纯度的CD8+T细胞是很好的方法，然而这种制备方法成本高。临床更多以外周血来源规模化制备T细胞群。这样获得T细胞群包括粒细胞、B细胞、CD4+T细胞、血小板、NK细胞。而真正获得CD8+T细胞占淋巴细胞不足40％,占整体细胞比例将更低。

此外，通过传统制备方法获得的T细胞群抗肿瘤活性和功能有限，且不能避免肿瘤免疫耐受的缺陷和免疫“耗竭”的现象，使得对肿瘤细胞杀伤能力有限。人为设计基因编码、引入过多外源抗体、蛋白虽能提高T细胞的抗瘤活性，但造成成本、副作用的增加。