[发明专利]表面活化的荧光乳胶微球的制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种表面活化的荧光乳胶微球的制备方法，包括以下步骤：将表面修饰羟基的荧光乳胶微球分散，加入催化剂，搅拌至溶解，加入环氧氯丙烷并搅拌；加入碱并搅拌，清洗，得到表面活化的荧光乳胶微球。本发明通过对羟基改性得到表面有环氧基团修饰的荧光乳胶微球，此表面活化的微球可一步结合抗体，简化了偶联工艺，在抗体偶联中显示出较高的反应活性。

技术领域

本发明涉及高分子材料技术领域，尤其涉及一种表面活化的荧光乳胶微球的制备方法及应用。

背景技术

乳胶微球是由高聚合材料合成的纳米级球形的标记材料，根据表面官能团的不同可分为羧基化、氨基化、巯基化乳胶微球，还可以包裹不同颜色染料，使其颜色丰富，可满足多种实验的要求。因其稳定性问题，在使用之前，微球表面是未经活化的，没有吸附或化学胶连能力，使用时必须先经活化处理，荧光乳胶微球才能借助于微球表面丰富的功能基团(如羧基、氨基等)与抗体或者抗原共价结合，进而捕获相应的待测物，之后通过荧光信号的强弱实现相应生物分子的定量检测。

微球与抗原/抗体共价结合常采用的偶联方法为EDC/NHS法。首先使用水溶性的碳二亚胺EDC对微球上的羧基官能团进行活化生成活性酯中间体，该活性酯中间体可直接与含氨基的生物分子高效结合，从而将生物分子偶联到微球表面。但由EDC反应形成的活性酯中间体稳定性较差，容易水解，可通过引入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成另一更稳定的活性酯中间体，与氨基发生取代反应形成酰胺键，较大提高生物分子的结合效率。但在活化偶联工艺中，活化完成后需要对试剂进行洗脱处理，大致流程为活化、离心、洗涤、分散、加入蛋白结合、配成试剂，这个过程中还是存在很多不稳定的情况，如微球团聚、活化效果差、偶联效率低，如何更高效稳定地进行微球和生物分子的结合成为乳胶微球生物应用中亟待解决的关键问题。

CN1246351C公开了一种环氧功能型交联核壳结构纳米高分子微球，在乳化剂和引发剂存在的条件下通过以水为介质的乳液或悬浮聚合得到了具有核壳结构、纳米尺度、表面带有环氧官能团的高分子微球；CN103386282B采用带环氧基的硅烷偶联剂得到表面环氧基活化的磁性微球，但构建方式均较为复杂。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明通过对羟基改性得到表面有环氧基团修饰的荧光乳胶微球，此表面活化的微球可一步结合抗体，简化了偶联工艺，因此避免了传统活化偶联工艺中出现的微球团聚、活化效果差和偶联效率低的问题。

本发明的一种表面活化的荧光乳胶微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)将表面修饰羟基的荧光乳胶微球分散，加入催化剂，搅拌至溶解，加入环氧氯丙烷并搅拌；

(2)向步骤(1)的混合溶液中加入碱并搅拌，清洗，得到表面活化的荧光乳胶微球。

本发明在催化剂作用下，环氧氯丙烷上的环氧基与微球表面的羟基反应开环，使开环后的环氧氯丙烷接枝到羟基微球表面，之后在碱性条件下脱氯化氢、闭环，得到环氧基表面的微球。环氧基活化的微球与生物分子的共价连接不需要其他活化剂的加入，同时，两步反应提高了微球表面羟基的反应效率，保证后续环氧基团的高得率。两步反应如下所示：

进一步地，表面修饰羟基的荧光乳胶微球、催化剂、环氧氯丙烷和碱的质量比为1:0.01-0.1:0.1-10:0.1-10。

进一步地，环氧氯丙烷和碱的质量比为1:1-1.1。此质量比的目的是，经闭环得到的环氧基不会在过高碱溶液存在下发生碱性开环，从而保证环氧基的得率。

进一步地，在步骤(1)中，荧光乳胶微球选自含有荧光的聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球和聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球中的一种或多种，尺寸为100-1000nm。

进一步地，在步骤(1)中，催化剂为Lewis酸。

进一步地，Lewis酸选自三氯化铝、三氟化硼或三氟甲烷磺酸中的一种或多种。