[发明专利]酶法生产DL-酪氨酸的方法及广谱型氨基酸消旋酶、应用

权利要求书

1.一种酶法生产DL-酪氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、构建重组表达载体pET32a-PH0138，转化到大肠杆菌BL21(DE3)/pG-KJE8中，获得重组工程菌BBAR，构建重组表达载体pET32a-PH0138采用的基因如SEQ ID NO.1所示，该基因为基于Pyrococcus horikoshii OT3编码的广谱型氨基酸消旋酶的基因序列，进行密码子优化获得PH0138基因；

S2、发酵表达BAR酶的重组工程菌BBAR获得湿菌体；

S3、将湿菌体混悬后进行破碎处理，破碎液为含有广谱型氨基酸消旋酶的粗酶液；

S4、向步骤S3获得的粗酶液中添加L-酪氨酸和PLP，搅拌转化，直至比旋光度为0°时终止反应，获得DL-酪氨酸水溶液。

2.根据权利要求1所述的一种酶法生产DL-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤S1中，重组工程菌BBAR的具体构建过程如下：

S11、基于Pyrococcus horikoshii OT3编码的广谱型氨基酸消旋酶的基因序列，进行密码子优化获得PH0138基因，如SEQ ID NO.1所示，克隆构建pUC57-PH0138载体，插入片段PH0138两端携带NdeI和XhoI酶切位点；

S12、分别用Nde I和Xho I双酶切pUC57-PH0138载体和pET-32a(+)质粒，获得目的基因片段和载体骨架，将目的基因片段和载体骨架按一定比例连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，构建得到pET32a-PH0138重组表达载体；

S13、将pET32a-PH0138表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)/pG-KJE8感受态细胞，涂布氨苄氯霉素双抗平板，筛选获得重组工程菌BBAR。

3.根据权利要求1所述的一种酶法生产DL-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤S2中，发酵表达过程如下：

在无菌环境下移种重组工程菌BBAR于一级培养基中，37℃、220rpm培养7h，OD600达到3～4后转接到二级培养基中，37℃、220rpm培养4～5h，再接入发酵罐中进行发酵培养，在发酵培养过程中，pH和溶氧上升时，补充补料培养基，菌浓度OD600达到20～25时，添加四环素，终浓度1mg/L，继续培养至菌浓度OD600为30时开始降温至30℃，加入IPTG诱导培养后放罐，离心获得湿菌体。

4.根据权利要求3所述的一种酶法生产DL-酪氨酸的方法，其特征在于，一级培养基采用LB培养基；二级培养基采用TB培养基。

5.根据权利要求3所述的一种酶法生产DL-酪氨酸的方法，其特征在于，发酵培养采用发酵培养基，发酵培养基的配方如下：

酵母浸膏5.6g/L，蛋白胨12g/L，甘油10g/L，三水合磷酸氢二钾4g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，七水合硫酸镁0.49g/L，柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L。

6.根据权利要求3所述的一种酶法生产DL-酪氨酸的方法，其特征在于，补料培养基的配方如下：

酵母浸粉70g/L，蛋白胨30g/L，甘油400g/L。

7.根据权利要求1所述的一种酶法生产DL-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤S3中，湿菌体混悬时加入磷酸钾缓冲液，破碎处理用超声波粉碎机或者高压匀浆机进行破胞处理。

8.根据权利要求1所述的一种酶法生产DL-酪氨酸的方法，其特征在于，还包括对DL-酪氨酸水溶液的后处理：

转化结束后，向转化液中添加盐酸溶液，待DL-酪氨酸完全溶解后，保温一段时间，过滤收集清液，缓慢调节pH至5.68，析出大量DL-酪氨酸，依次经过抽滤、洗涤和烘干得到DL-酪氨酸成品。