[发明专利]一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法

权利要求书

1.一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和牙周病变的第三磨牙，用75％酒精牙齿表面进行消毒，随后使用牙科钻头取出牙髓；

步骤二：将牙髓用消毒后的小刀切成1mm的小块，共三小块；

步骤三：用含有2.5％抗生素的PBS冲洗3次，随后将牙髓组织放入1.5mlEP管中用3mg/ml的I型胶原酶消化-4mg/mL的分散酶37℃放置30分钟；

步骤四：将牙髓细胞重悬至5％CO2温箱中培养(培养基：DMEM+10％的胎牛血清+100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素)，温度设置为20-40℃，5天之后换液，之后每3天更换一次；

步骤五：待到第一代细胞融合至80％左右后，消化离心处理后，取出5000个左右细胞在45孔板中进行种植并进行免疫荧光鉴定，剩余细胞均匀种植在两个100mm的培养皿中，将两组细胞分别命名为对照组和实验组；

步骤六：将牙髓干细胞接种在100mm培养基中，待到细胞融合至80％左右后，将对照组的培养基去除，用PSB清洗三次后更换为无血清DMEM培养基，将实验组的培养基更换为无糖DMEM培养基，并将培养皿置于厌氧培养罐(三菱产气罐AnaeroPackTM)(37℃、100％CO2、)中继续培养90min后，将培养板中的无糖DMEM更换为DMED培养基并置于普通培养箱继续培养48小时；

步骤七：分别对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取，随后对蛋白进行提取；

步骤八：测定蛋白浓度和蛋白标记物CD63、CD9的含量，最后统计对照组和实验组的浓度差异。

2.根据权利要求1所述的一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，其特征在于：所述步骤五中，将所有细胞平均种植于两组培养皿中，随后再将两组培养皿分别命名为对照组和实验组，并对实验组内的牙髓干细胞进行糖氧剥夺处理。

3.根据权利要求1所述的一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，其特征在于：所述步骤七中，对对照组和实验组内的牙髓干细胞的外泌体进行提取时，采用多聚物沉淀法进行提取。

4.根据权利要求1所述的一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，其特征在于：所述步骤八中，对对照组和实验组的牙髓干细胞内的蛋白浓度进行测定时采用BCA测定，二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的BCASolution A(含有BCA)相互作用产生敏感的颜色反应，两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物，水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。