[发明专利]一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法

权利要求书

1.一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)组织预处理：

将显微手术获得的睾丸组织立即放入盛有精子洗涤培养液的培养皿中，并用精子洗涤培养液清洗睾丸组织后备用；

(2)组织切割：

在培养皿中，将数块睾丸组织集中，使用两支睾丸组织体外切割手术刀的刀刃相互穿插、交错，不断切割、分离睾丸组织，直到肉眼可见的块状组织全部切碎；

(3)寻找活动精子：

在倒置显微镜下，观察上述培养皿内有无精子存在以及精子是否活动，发现足够的活体精子即可结束睾丸切开的手术；

(4)组织培养：

把上述培养皿里切碎的组织，用巴氏吸管加入2ml-3ml精子洗涤培养液充分吹打混匀后，转移到无菌离心管A中，离心管管盖拧紧放置在37℃培养箱中过夜培养；

(5)分离组织：

将离心管A放入高速离心机，采用瞬时离心法去除睾丸组织切割后的碎片，所述的瞬时离心法具体操作为：启动离心后，当达到200g离心力时立即按停止键，待离心机停止转动，小心取出离心管A，用巴氏吸管吸取上清液转移到37℃预温的无菌离心管B中，离心管B中盛有3ml含体积比5％的人血清白蛋白的精子洗涤培养液；

(6)提取：

使用巴氏吸管将离心管B中组织液体充分吹打混匀，再放入高速离心机，用400g-600g离心力离心5分钟；离心停止后，使用巴氏吸管至上而下缓慢轻柔地吸取上清液并丢弃，保留0.3ml底部沉淀液体；

(7)配制悬液：

在离心管B中加入0.2ml-0.3ml含体积比5％的人血清白蛋白的精子洗涤培养液，用巴氏吸管轻轻地吹打混匀，尽量避免产生气泡，得到睾丸组织活体单精子悬液，然后取出5μl悬液置于细胞计数板上，观察到存在精子，且精子的活动情况和数量满足要求，即可放置到37℃培养箱中备用。

2.根据权利要求1所述的一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的睾丸组织为男性无精症患者经过外科显微手术所获得可能含有精子的睾丸生精小管。

3.根据权利要求1所述的一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的睾丸组织体外切割手术刀包括刀头和刀柄，所述的刀头包括刀头本体和2-5片刃式刀片，所述的刀头本体前部为圆台形，后部为圆柱形，后端设有连接孔，所述的刀片相互平行，并列设置在刀头本体的前端，刀片之间间隔2-4mm，刀刃呈倾斜状；所述的刀柄包括连接头和刀柄本体，连接头设在刀柄本体前端；刀头的连接孔嵌套并紧固在刀柄的连接头上形成一体。

4.根据权利要求1所述的一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法，其特征在于：步骤(3)中使用倒置显微镜在200-400倍下从上到下S形逐层或者从左到右波浪形逐排查找并观察精子。

5.根据权利要求1所述的一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法，其特征在于：步骤(4)转移睾丸组织过程中，使用3ml巴氏吸管吸取睾丸组织转移至离心管A中，并用0.5ml-1ml精子洗涤培养液冲洗培养皿1-2次，收集冲洗液至离心管A中，保证睾丸组织全部转移到离心管A中。

6.根据权利要求1所述的一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法，其特征在于：所述的离心管A和离心管B分别为15ml圆锥形底离心管。