[发明专利]一种OXLD1基因过表达的细胞株及其构建方法

说明书

本发明提供了一种OXLD1基因过表达的细胞株及其构建方法，以及构建细胞株的过表达载体及其构建方法。构建出的细胞株能够长期持续稳定过表达大鼠OXLD1，避免瞬时感染基因表达持续时间短且不稳定的缺陷。同时，弥补现有技术中对于OXLD1基因在细胞能量代谢方面研究的空白以及推动对于线粒体功能的研究。

技术领域

本发明涉及细胞生物技术领域，具体涉及一种OXLD1基因过表达细胞株的构建方法。

背景技术

线粒体结构损伤与心功能障碍有着密不可分的联系，维持线粒体结构正常，人工增加其表达可能是一种新的治疗方法。OXLD1(Oxidoreductase-Like Domain-ContainingProtein1)预测其与线粒体复合物V组装因子相互作用，与线粒体氧化呼吸功能相关，在决定心功能方面有着十分重要的作用。研究发现线粒体复合物V组装因子参与细胞应激反应(例如参考文献：Inoue N等，Unbiased compound screening with a reporter geneassay highlights the role of p13 in the cardiac cellular stress response，Biochem Biophys Res Commun，2018，495(2):1992-1997)。

OXLD1基因在细胞能量代谢方面研究还存在空白，故本申请构建了OXLD1基因过表达的稳转细胞株，其长期持续稳定过表达OXLD1，对于线粒体功能的研究具有推动作用。

发明内容

本发明提供了一种OXLD1基因过表达的细胞株，所述的细胞株的染色体上包含OXLD1基因。

优选的，所述的OXLD1基因可以来源于大鼠、蜥蜴或斑马鱼。进一步优选来源于大鼠。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的OXLD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，所述的细胞株为心肌细胞，例如来源于人或非人动物的心肌细胞，进一步优选为大鼠心肌细胞系。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞株为大鼠心肌细胞系H9C2细胞。

优选的，所述的细胞株中稳定过表达OXLD1基因。

优选的，所述的细胞株可以为稳定转染或瞬时转染后偶然筛选获得。

本发明还提供了上述细胞株的构建方法。其选自磷酸钙法、脂质体介导法或病毒介导法等可以制备稳转细胞株的方法。

优选的，所述的构建方法包括：

a)构建包含OXLD1基因的过表达载体；

b)将步骤a)所述的过表达载体转染至H9C2细胞；优选的，所述的转染为使用Lipofectamine 3000进行转染。

c)抗性筛选获得OXLD1基因过表达的细胞株。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括：

a)构建包含OXLD1基因的过表达载体，将过表达载体转化至感受态细菌，培养并提取过表达载体的质粒；

优选的，获得OXLD1基因的方法包括利用包含两个酶切位点的引物对，PCR扩增OXLD1基因。进一步优选的，所述的酶切位点为XhoI和KpnI。

优选的，所述的酶切反应体系为XhoI用量为6-20U，KpnI用量为8-20U，酶切反应缓冲液为10×，OXLD1用量为1-3μg，载体用量为1-3μg。酶切反应体系体积为20-50μL。

步骤2.3将连接反应的产物转化Stbl3感受态细菌，涂布氨苄抗性的LB平板，优选的37℃倒置培养18小时，将菌落PCR阳性的菌落进行小摇，保菌并提取质粒。