[发明专利]双荧光团的酶测定法

权利要求书

1.用于鉴定至少一个肉毒杆菌神经毒素BoNT蛋白酶的酶活性的基于细胞的测定法的细胞包括：

蛋白水解酶；以及

报告构建体，包括

i)膜锚定域，其包含与细胞膜形成复合物的第一肽；

ii)报告域，其包括包含与绿色荧光蛋白的序列具有至少80％序列同源性的荧光蛋白的至少两个第二肽，其中第一个所述第二肽产生第一波长的第一信号，第二个所述第二肽产生第一波长的第二信号，其中所述报告域产生集合信号，所述集合信号为所述第一信号和所述第二信号的累加；

iii)切割位点，其包括第三肽，所述切割位点插入任意两个所述膜锚定域与所述至少两个第二肽之间，

其中第三肽构造为当所述报告构建体暴露于所述酶活性时会经历切割事件，

其中所述荧光蛋白选择为易受所述切割事件之后的细胞胞质溶胶中的蛋白水解的影响，

其中所述集合信号在失去所述第一信号或所述第二信号中的任何一个时仍能被观察到；

其中所述第二肽选自由YFP和eYFP组成的组。

2.根据权利要求1所述的细胞，其中第一个所述第二肽易受细胞胞质溶胶中的第一降解事件的影响，第二个所述第二肽易受在切割事件之后的细胞胞质溶胶中的第二降解事件的影响，其中所述第一降解事件导致所述第一信号的产生的损失，所述第二降解事件导致所述第二信号的产生的损失。

3.根据权利要求1所述的细胞，其还包括插入第一个所述第二肽与第二个所述第二肽之间的接头肽。

4.根据权利要求1所述的细胞，其中所述绿色荧光蛋白具有SEQ ID NO.10的序列。

5.根据权利要求1所述的细胞，其中所述第三肽是SNARE蛋白。

6.根据权利要求1所述的细胞，其还包括辅助报告域，其提供第二波长的信号，其中第二波长可与所述第一波长区分。

7.根据权利要求1所述的细胞，其中相对于包含单个所述第二肽的报告构建体，所述报告构建体示出第一BoNT蛋白酶的酶活性和第二BoNT蛋白酶的酶活性之间的减小的敏感性偏差，其中所述第三肽配置为当所述构建体暴露于所述第一酶活性或所述第二酶活性时经历切割事件。

8.根据权利要求7所述的细胞，其中所述第一BoNT蛋白酶为BoNT/A，所述第二BoNT蛋白酶为BoNT/E。

9.根据权利要求1所述的细胞，其中所述报告构建体表现出等于或小于5％的荧光剂之间的能量传递。