[发明专利]一种细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法及在高通量测序中的应用

说明书

本发明公开了一种细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1、检测受试者样品中细胞表面脆弱微生物，步骤S2、样本制备，步骤S3、微生物DNA进行文库构建并进行测序，步骤S4、数据分析和出具报告。本发明还公开了所述细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法在高通量测序中的应用。本发明公开的细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法可以选择性地保护脆弱微生物的完整性，大大提高了样本中该类微生物的检测阳性率，完善了高通量测序方法检测病原微生物的种类和范围，提升了通过此类技术手段辅助诊断的意义；检测结果检测效率高，适用于临床样本中脆弱微生物检测及该类微生物群落研究等领域。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种基于高通量测序的临床样本中细胞表面脆弱(细胞壁薄/不稳定/无细胞壁等)微生物核酸富集的方法及其应用。

背景技术

近年来，随着二代测序技术的应用，宏基因组病原体测序使高通量、精准的遗传学研究在诊断领域成为可能。但临床样本中，病原体相较宿主细胞含量极微，极大程度降低了病原体检测灵敏度，因此病原体的富集对临床样本中微生物的检测有重大作用。

目前病原体在提取过程中的富集主要分为提取前富集(Pre-Extraction)和提取后富集(Post-Extraction)两种形式。提取前富集主要发生在细胞层面，通过细胞水平的差异完成宿主与微生物细胞分离，去除宿主核酸后获得微生物细胞，并通过核酸提取步骤富集微生物核酸；提取后富集主要发生在核酸层面，细胞破碎后通过探针法靶向性捕获微生物核酸，或者通过宿主与微生物核酸甲基化差异，完成富集。

在提取后富集的方式中，通过探针法进行提取后富集靶向性范围小而应用受到限制；甲基化差异很难区分宿主与真核微生物核酸(及部分原核生物核酸)。提取前富集中，需考虑临床微生物常见病原体细胞壁表面结构差异较大，存在刚性较强的革兰氏阳性细菌(表面肽聚糖层多)及真菌，同时存在细胞壁薄/不稳定的微生物(如支原体、衣原体及部分革兰氏阴性细菌等)，后者极易受到宿主细胞破碎时的干扰而被去除，从而导致本类病原体在测序结果中的遗漏，贻误病情判断。

基于上述背景，本发明旨在提供一种基于宏基因组学高通量微生物测序技术中针对细胞表面脆弱微生物的富集方式。

本发明基于高通量测序技术构建了区分宿主细胞与细胞表面脆弱微生物(如支原体、衣原体等)的裂解液配比组合。本发明可区分宿主细胞与该类病原体细胞表面(如支原体、衣原体等)。基于本发明的检测方法，可有效提升高通量测序中这类病原体的检测灵敏度，提升相关病原体相关高通量测序的检出率。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法及在高通量测序中的应用，该方法通过研制新型裂解液配方，在裂解宿主细胞的同时，可以选择性地保护脆弱微生物的完整性，大大提高了样本中该类微生物的检测阳性率，完善了高通量测序方法检测病原微生物的种类和范围，提升了通过此类技术手段辅助诊断的意义；检测结果检测效率高，适用于临床样本中脆弱微生物检测及该类微生物群落研究等领域。

为达到以上目的，本发明采用的技术方案为：一种细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1、检测受试者样品中细胞表面脆弱微生物：采用检测受试者样品中细胞表面脆弱微生物的高通量测序检测方法测受试者样品中细胞表面脆弱微生物；

步骤S2、样本制备：选取核酸提取样本，然后依次进行采用裂解试剂对临床样本中宿主细胞裂解、宿主核酸去除、细胞表面脆弱微生物裂解及核酸提取；其中宿主核酸去除试剂成分为TURBO^TMDNase(2U/μL)1-5μL；细胞表面脆弱微生物裂解及核酸提取是采用QIAampUCPPathogen Mini Kit或其它具有相似功能的试剂盒完成的；

步骤S3、微生物DNA进行文库构建并进行测序；

步骤S4、数据分析和出具报告。