[发明专利]一种非洲猪瘟病毒基因缺失株及其构建方法和用途

说明书

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒基因缺失株及其构建方法和用途，所述非洲猪瘟病毒基因缺失株是将非洲猪瘟病毒的CD2v基因缺失后得到的，所述非洲猪瘟病毒基因缺失株带有红色荧光标记基因。该非洲猪瘟病毒基因缺失株带有红色荧光标记基因，可用于直观地体外评价非洲猪瘟疫苗的抗体水平或者相关药物筛选。

技术领域

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒基因缺失株及其构建方法和用途。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种猪的病毒性疾病，主要感染家猪和野猪，可引起猪只发热，食欲减退，呼吸困难，内脏器官广泛性出血，神经系统紊乱等临床症状，一旦感染，致死率高达100％，对全球养猪业具有严重的破坏性。目前，ASF被世界动物卫生组织(OIE)列为“法定报告动物疾病”，也是我国重点防范的一类动物疫病。

非洲猪瘟病毒(African swine fever Virus，ASFV)是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)的唯一成员，也是已知的唯一DNA虫媒病毒。ASFV的基因组为一个大的双链DNA，病毒基因紧密分布，编码在两条DNA链上，没有内含子，基因末端带有反向重复序列和发夹环。基因组大小从170kb到190kb不等，包含151-167个基因，有五十多个基因编码病毒的结构蛋白，除结构蛋白以外，病毒含有完整的酶和与病毒转录有关的因子，编码调节宿主细胞功能及与病毒免疫逃逸相关的蛋白等。由于ASFV基因组较大，确定诱导保护性免疫应答的病毒抗原难度较大，大部分基因的基因功能并未明确，免疫逃逸机制复杂，一般是由多个毒力基因及免疫抑制基因共同发挥作用，感染与致病机制不清，疫苗创制的理论认知有限，其流行已逾百年，但仍未有商品化的疫苗问世。

在疫苗的研发过程中，了解基因的功能至关重要。ASFV基因组集成了抑制干扰素产生、调控细胞凋亡和自噬等多种免疫逃避机制，编码了多种病毒蛋白参与调控宿主的免疫应答。在多基因家族中，MGF360和MGF505/530能够抑制宿主干扰素的产生和的产生和调控促炎性细胞因子表达，是ASFV的毒力基因。有研究表明，A179L、A224、EP153R能够抑制宿主细胞的凋亡，该三种蛋白能够广泛的作用于细胞中抑制凋亡的信号通路。DP71L能通过和磷酸酶1催化亚基的催化位点作用，抑制eIF2的磷酸化，进而影响细胞的蛋白翻译。E183L蛋白能够激活与细胞凋亡相关信号通路，在病毒感染后期，促进细胞裂解，便于子代病毒粒子的进一步的感染复制。I329L与TRIF竞争性地结合TLR3，从而拮抗TLR3介导的NF-κB和IRF3活化。A238L对NF-κB信号通路产生抑制作用，而随着感染进程的推进，ASFV感染细胞晚期，A224L表达凋亡抑制蛋白能够激活NF-κB信号通路，通过抑制细胞凋亡促进ASFV感染细胞的存活。DP96R可以通过抑制TBK1和IKKβ活化而抑制cGAS/STING介导的I型干扰素表达和NF-κB活化。CD2v由EP402R基因编码，该蛋白有助于病毒黏附在红细胞表面，被感染细胞可在其周围形成玫瑰花样的红细胞花环，避免被感染细胞被T细胞及NK细胞的杀伤，在I型毒株BA71v中，缺失CD2v基因的BA71v毒株可产生对亲本毒株的同源保护，同时可产生部分异源保护，说明CD2v基因是该病毒的毒力基因。但该基因在中国流行株(基因II型)和MalawiLil-20/1株(基因II型)中的缺失却不足以完全致弱毒株。据报道，2020年6月-2020年12月，有科研机构在中国北方的7个省份进行了非洲猪瘟病毒监测，总共分离出22株病毒，均为基因II型，其中有11株毒株在CD2v蛋白(由EP402R基因编码)上有变异或缺失，并且表现为非红细胞吸附(non-HAD)。在动物实验中，其中，具有红细胞吸附(HAD)的两个毒株表现出强毒力；而非红细胞吸附(non-HAD)的两个毒株的毒力降低，但传播性增强，其临床表现与剂量相关。我国地域辽阔，虽然在我国流行的ASFV毒株均属于基因型II型毒株，但不同地区的分离株在疾病临床表现上有所差异，同时，在疫苗的研发过程中，不同的毒株采用相同的弱毒株构建策略，其效果却不尽相同。有必要针对本地区的流行毒株进行深入研究，为疾病的防控提供理论基础。