[发明专利]CsSH1基因在提高黄瓜苗期耐徒长中的应用和方法

说明书

本发明涉及CsSH1基因在提高黄瓜苗期耐徒长中的应用，通过CRISPR/Cas9系统编辑CsSH1基因，使CsSH1基因功能失活来提高黄瓜苗期的耐徒长性。本发明的有益效果在于：(1)利用基因编辑技术获得耐徒长的黄瓜植株，较传统的育种方法更经济、有效，是一种创建抗性材料的好方法，大大缩短了育种年限；(2)提供了耐徒长的黄瓜基因编辑植株，为选育苗期耐徒长黄瓜杂交种提供了新的育种材料。

一、技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用CRISPR/Cas9系统编辑CsSH1基因，进而获得苗期耐徒长黄瓜的黄瓜品种。

二、背景技术

黄瓜是重要的蔬菜作物。中国的黄瓜种植面积、产量和人均年消费量均居世界首位。我国黄瓜生产以设施栽培为主，基本实现了周年供应。在生产过程中，培育壮苗是黄瓜生产中防治病虫害，获得高产的基础，但由于秋冬茬育苗期(7-8月)的高温高湿，越冬茬和冬春茬育苗期(11月后)的光照不足等气候因素，经常造成秧苗徒长问题。徒长黄瓜幼苗茎秆纤细、节间长、叶片薄而色淡，这种秧苗根系弱小，抗性差，栽植后缓苗期长，成活率低，很难获得早熟与丰产。加强保护地内的温、湿、光照和水肥管理，甚至使用一些激素类制剂能够在一定程度上防治黄瓜幼苗徒长，但偶遇极端气候就会造成生产问题，同时增加了生产成本。因此，培育苗期耐徒长的黄瓜品种是彻底解决黄瓜育苗徒长问题的最佳途径。

发明人团队在前期研究发现，源自我国云南省西双版纳地区的半野生资源材料西双版纳黄瓜(Cucumis sativus L.var.xishuangbannanesis Qi et Yuan)表现为苗期下胚轴短、耐徒长的特点。发明人团队前期研究通过利用西双版纳黄瓜自交系(SWCC8)和栽培黄瓜自交系‘北京截头’(CC3)构建了遗传定位群体，进一步通过构建遗传图谱结合基因组重测序，完成了西双版纳黄瓜短下胚轴基因CsSH1的图位克隆，并研究发现该基因的突变是导致黄瓜幼苗下胚轴矮壮、耐徒长的原因(Bo等，SHORT HYPOCOTYL1 Encodes a SMARCA3-Like Chromatin Remodeling Factor Regulating Elongation，Plant Physiology，2016)。CsSH1是一个极具商业价值的农艺性状基因，然而由于传统育种方法效率较低，CsSH1基因在黄瓜改良中应用不足。

基因编辑技术是利用靶向性的序列特异核酸酶对基因组进行定点突变或精准修饰的技术，其中CRISPR/Cas系统是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接，造成移码突变，导致基因敲除。这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注，在基因功能研究与作物的遗传改良中得到了广泛应用。目前随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展完善，可以在基因组的特定位点产DNA双链断裂，实现基因敲除、定点插入或替换，可以定向的对植物基因组进行编辑，并且通过后代的分离可已将含有转基因成分的植株分离出去，达到精确快速改良品种的目的。

三、发明内容

本发明要解决的技术问题是解决不良栽培环境下黄瓜幼苗徒长的问题，提供一种培育耐徒长黄瓜的新方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用CRISPR/Cas系统编辑黄瓜CsSH1基因从而制备苗期耐徒长黄瓜的方法。

本发明所编辑的与黄瓜下胚轴发育相关的基因，名称为CsSH1。CsSH1基因编码一个RAD5同源蛋白，在DNA修复过程中发挥功能。在西双版纳黄瓜中CsSH1携带了一个罕见的变异位点，这个变异可能导致了基因功能的丧失，从而使黄瓜幼苗矮壮、耐徒长。所述黄瓜CsSH1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，本发明分别在CsSH1基因第1外显子处设计2个sgRNA位点，分别记为sgRNAexon1-1、sgRNAexon1-2，均位于该基因的第1个外显子(见附图1)，序列如下所示：