[发明专利]一种筛选优质成骨分化潜能间充质干细胞量化标准的构建方法及应用

权利要求书

1.一种筛选优质成骨分化潜能间充质干细胞量化标准的构建方法，其特征在于：

包括以下步骤：

步骤一、从若干株男性人脐带中原代分离、扩增脐带间充质干细胞，传代培养至P5代；

步骤二、分别加入成骨分化液诱导向成骨细胞分化：将若干株P5代脐带间充质干细胞，经过消化、离心、重悬、计数后，加至6孔板内培养，每孔定量细胞为1×10⁵；每株细胞铺板6孔，细胞密度达到60 ～ 70 % 融合度时，其中3孔设为对照组，培养过程中一直更换脐带间充质干细胞的完全培养基；完全培养基为1L低糖MEM中加入：10 % 胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/mL链霉素；另外3孔设为实验组，培养过程中一直更换成骨分化诱导培养基；成骨分化诱导培养基为1L低糖MEM中加入：体积比为10 % 胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/mL链霉素、10 μmol/L抗坏血酸、1.8 mmol/L磷酸二氢钾、10 nmol/L地塞米松；每三天更换一次培养基，共培养21天；

步骤三、诱导培养21天后，分别进行茜素红染色，采集图片；

步骤四、将步骤三所获得的图片采用image J软件分析，得到图片中茜素红着色面积百分比，若干株脐带间充质干细胞的茜素红着色面积百分比取平均值，获得筛选优质成骨分化潜能间充质干细胞量化标准；

筛选优质成骨分化潜能间充质干细胞量化标准的应用方法为：诱导待筛选细胞进行向成骨细胞分化，诱导培养后进行茜素红染色，采集图片，利用image J软件分析图片，得到图片中茜素红着色面积百分比；将待筛选细胞的茜素红着色面积百分与筛选优质成骨分化潜能间充质干细胞量化标准比较，大于量化标准的细胞则为优质成骨分化潜能间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的筛选优质成骨分化潜能间充质干细胞量化标准的构建方法，其特征在于：

步骤一中，人脐带间充质干细胞的分离及扩增的方法为：无菌条件下采集人脐带，清洗脐带血迹、剔除脐带动静脉血管、剪碎、贴壁培养、消化、离心、重悬、接种后培养至 80 ～90 %融合，细胞消化传代扩增培养，第5代处于对数期的脐带间充质干细胞待用。

3.根据权利要求1所述的筛选优质成骨分化潜能间充质干细胞量化标准的构建方法，其特征在于：

步骤三中，所有孔内细胞进行茜素红染色，具体方法为：所有孔弃液，PBS洗3次，4 %多聚甲醛固定30 min，后用PBS清洗3遍，加茜红素染液1 mL/孔染色15 min，后用PBS清洗3遍；

染色结束后，显微镜下采集照片，每孔采集5张图片，每株细胞实验组和对照组分别采集15张。

4.根据权利要求2所述的筛选优质成骨分化潜能间充质干细胞量化标准的构建方法，其特征在于：

步骤四中，采用image J软件分析采集的图片，得出每张图片茜素红着色面积百分比，取每孔全部图片的平均值，再取每株细胞全部孔的平均值，得到每株细胞的茜素红着色面积百分比；

若干株细胞的茜素红着色面积百分比取平均值，获得筛选优质成骨分化潜能间充质干细胞量化标准。

5.根据权利要求1所述的筛选优质成骨分化潜能间充质干细胞量化标准的构建方法，其特征在于：

步骤四中，脐带间充质干细胞的株数为6株，6株男性脐带间充质干细胞的茜素红着色面积百分比取平均值为40%。