[发明专利]一种绿色荧光蛋白标记月季镰刀菌的制备方法及应用

说明书

本发明属于植物病理学领域，提供一种绿色荧光蛋白标记月季镰刀菌的制备方法及应用，以月季镰刀菌菌株YJ1为转化体，利用PEG介导原生质体的遗传转化方法将绿色荧光蛋白基因标记月季镰刀菌菌株YJ1，获得标记绿色荧光蛋白的月季镰刀菌菌株YJ1‑GFP，可用于月季镰刀菌菌株突变体库的构建，筛选、寄主抗性定量鉴定、寄主对月季镰刀菌菌株侵染的响应机制及月季镰刀菌菌株侵染和致病机理研究。本发明提供的提供一种绿色荧光蛋白标记月季镰刀菌的制备方法，快速方便，步骤简化，耗时短，能直接在平板上挑取绿色荧光蛋白标记的月季镰刀菌菌株YJ1‑GFP。

技术领域

本发明属于植物病理学技术领域，具体涉及一种绿色荧光蛋白标记月季镰刀菌的制备方法及应用。

背景技术

月季枯萎病是由月季镰刀菌(Fusarium rosicola sp.nov.)引起的维管束系统性真菌病害，该菌可侵染月季根茎叶各个部位，病害症状前期叶片褪绿变黄，逐渐脱落，最后造成月季整株枯死。月季镰刀菌寄主范围广泛，可危害蔷薇科的月季、玫瑰、蔷薇和樱花等多种花卉。冬春日光温室及早春、秋后大棚栽培均有发生，且危害极其严重。要获得抗病品种，首先要了解月季镰刀菌的分子遗传基础和致病机制，目前国内外对于月季枯萎病的病原菌的鉴定，类群分析研究已取得了一些进展，但缺乏对月季镰刀菌致病机理的认识。

稳定表达绿色荧光蛋白标记月季镰刀菌对于研究月季镰刀菌致病相关基因、侵染过程和致病机理，对于研究月季镰刀菌侵染致病过程的组织学研究和月季镰刀菌致病相关基因、病原菌与寄主互作以及病原菌的功能基因组学研究奠定基础，同时，为月季枯萎病的控制和月季抗枯萎病抗病育种材料获得提供理论基础。然而，目前，国内外已有利用不同遗传转化方法转化绿色荧光蛋白标记(GFP)真菌的报道，但已报道的GFP标记真菌菌株方法或未涉及具体标记相关细节，或标记转化步骤繁琐，效率低下，荧光强度不稳定。目前还没有可参考的月季枯萎病病原菌月季镰刀菌GFP标记菌株及方法的报道，这已经成为月季枯萎病菌侵染致病过程与机理研究的瓶颈。因此，急需获得稳定表达绿色荧光蛋白标记月季镰刀菌及方法。

发明内容

本发明提供一种绿色荧光蛋白标记月季镰刀菌的制备方法及应用，以月季镰刀菌菌株YJ1为转化体，利用PEG介导原生质体的遗传转化方法将绿色荧光蛋白基因标记月季镰刀菌菌株YJ1，获得标记绿色荧光蛋白的月季镰刀菌菌株YJ1-GFP，可用于月季镰刀菌菌株突变体库的构建，筛选、寄主抗性定量鉴定、寄主对月季镰刀菌菌株侵染的响应机制及月季镰刀菌菌株侵染和致病机理研究。

本发明所使用的月季镰刀菌(Fusarium rosicolasp.nov.)YJ1，于2020年11月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，其保藏编号是CCTCC No:AF2020053^T。

上述的月季镰刀菌(Fusarium rosicolasp.nov.)YJ1通过以下步骤筛选得到：

本实验于2020年6月在中国江苏省南京市浦口区发现了大面积的月季枯萎病，采集月季感病茎段，经过2-3天保湿培养，观察到大量的白色菌丝布满在茎段维管束内；用灭菌的接种针随机挑取白色菌丝接种到PDA培养基上，28℃培养，培养3天后，利用无菌挑针挑取菌落边缘部分接种至新的PDA平板上对菌株进行纯化，得到纯化菌株并编号为YJ1。经形态学描述和系统发育学分析，将其鉴定为新种并命名为Fusarium rosicolasp.nov.。

本发明的目的之一是提供一种绿色荧光蛋白标记月季镰刀菌的制备方法，包括以下步骤：

S1制备月季镰刀菌分生孢子液

月季镰刀菌为月季镰刀菌菌株YJ1，将月季镰刀菌YJ1在马铃薯固体培养基上培养4d后，使用无菌手术刀刮取30～40块规格为2×2mm的月季镰刀菌YJ1菌丝块，接种至CMC液体培养基中，置于暗室摇床上，250rmp、25℃摇72h,用两层滤膜过滤收集孢子于50mL离心管中，4000rpm，离心10min，弃废液，获得分生孢子液；