[发明专利]一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法

说明书

本发明属于农业生物学技术领域，涉及一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，该方法首先合成人工多肽，并将该人工多肽偶联到血蓝蛋白KLH上，以此为抗原对实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔进行免疫，经过多次加强免疫后从兔子体内获得血清进行效价检测，效价达到预期目标后即可分离血清，提纯获得多克隆抗体；本发明获得的多克隆抗体特异性强，可用于免疫沉淀、免疫组化等分子生物学实验及相关研究，为深入研究植物细胞自噬相关机理提供了有力的工具。

技术领域

本发明属于农业生物学技术领域，涉及一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法。

背景技术

细胞自噬是一种进化上非常保守的溶酶体/液泡降解途径，对生物有机体适应各种生物或非生物胁迫，以及维持自身生长发育具有重要意义。在细胞自噬发生过程中，由于自噬相关基因8(autophagy related gene 8，ATG8)的蛋白始终标记在自噬泡的膜状结构上，所以被用作自噬检测的金标准。在所有植物中，目前只制备出了拟南芥抗内源性ATG8蛋白的多克隆抗体，但其特异性较差，同时拟南芥的抗原序列至今未对外公开，更加限制了其在检测植物ATG8基因表达中的广泛应用。由于缺乏特异性较好的ATG8抗体，致使小麦细胞自噬研究进展相对缓慢。

因此，能否提供一种具有较好特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8的多克隆抗体成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术中的上述情况，本发明的发明人提供了一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8的多克隆抗体制备方法，该方法首先合成人工多肽，并将其偶联到血蓝蛋白KLH上，以此为抗原对实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔进行免疫，经过多次加强免疫后从兔子体内获得血清进行效价检测，效价达到预期目标后即可分离血清，提纯获得多克隆抗体；本发明获得的多克隆抗体特异性强，可以用于免疫沉淀、免疫组化等分子生物学实验及相关研究，为深入研究植物细胞自噬相关机理提供了有力的工具。

本发明的具体技术方案如下：

发明人首先利用小麦ATG8基因编码区N端第7-24位共18个氨基酸的人工合成多肽作为抗原，由于这18个氨基酸组成的多肽具有亲水性，免疫原性较好，故选其做抗原；

上述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

在上述人工合成多肽的基础上，发明人提供了一种特异性识别小麦内源自噬相关蛋白8多克隆抗体的制备方法，具体操作步骤如下：

(1)将5mg人工合成多肽(KTEHPLERRQAESARIRE)偶联到1mg血蓝蛋白KLH(KeyholeLimpet Hemocyaninn)；

(2)饲养实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各1只，待兔子长至1-2kg左右时，用注射器将充分混匀的1mL完全弗氏佐剂(液体石蜡：羊毛脂＝2:1)和1mL浓度为0.7mg/mL的纯多肽在每只兔子皮下注射第1针，标记为第1天；

(3)第12天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂(完全弗氏佐剂+终浓度20mg/mL的卡介苗)和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子皮下注射第2针；

(4)第26天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第3针；

(5)第40天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第4针；

(6)第54天，将充分混匀的1mL不完全弗氏佐剂和1mL浓度为0.35mg/mL的多肽在兔子肌肉注射第5针；

(7)第66天，取兔子血清进行Western blot验证。