[发明专利]非洲猪瘟病毒的引物组合、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒的引物组合，其特征在于，包括：

上游引物ASFV-MF：5’-TCAGTATCCATTCCCTTCG-3’；

下游引物ASFV-MR：5’-TTGTGCCAATCTCGGTGT-3’。

2.一种非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组合，记为PCRMix。

3.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括：阳性对照、阴性对照和PCR扩增液。

4.根据权利要求2或3所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述的PCR Mix中，上游引物ASFV-MF与下游引物ASFV-MR的摩尔比为1:1。

5.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为含有428bp的ASFV基因序列的重组质粒。

6.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照为双蒸水。

7.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增液包括Taq PCR Mix(2×)。

8.如权利要求2～7任一所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒的应用，其特征在于，将其应用于检测非洲猪瘟病毒，包括以下方法：

S1：提取待测样品的总DNA备用；

S2：配制反应体系：取样品DNA、PCR Mix和PCR扩增液，并用双蒸水定容至一定体积，配置得到反应体系；

S3：扩增程序：进行PCR扩增；

S4：琼脂糖凝胶电泳：在溶解的琼脂糖凝胶中，加入核酸染料轻轻摇匀，在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后取PCR扩增产物，点样于琼脂糖凝胶孔中，进行电泳，待Marker和条带都跑开后，由凝胶成像仪观察并拍照，获得检测结果；

S5：参照待测样品对阳性对照和阴性对照进行处理；

S6：结果判断。

9.根据权利要求8所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒的应用，其特征在于，步骤S6中：阳性对照出现428bp扩增条带，阴性对照无条带出现时，实验结果成立，待测样品出现428bp的扩增条带为非洲猪瘟病毒核酸阳性，否则为阴性。

10.根据权利要求8所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒的应用，其特征在于，包括以下条件中的任一项或多项：

(i)步骤S2中，取样品DNA 2μL，PCR Mix 2μL，PCR扩增液12.5μL，加入双蒸水10.5μL，配置25μL反应体系；

(ii)步骤S3中，扩增程序包括：94℃5min，循环94℃30s，55℃30s，72℃1min，共计35个循环，再72℃延伸10min；

(iii)步骤S4中，用1g琼脂糖放入100mL TAE中，得到1％的琼脂糖凝胶，于微波炉中溶解，再加入5μL的核酸染料轻轻摇匀，在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后取10μL PCR扩增产物，点样于琼脂糖凝胶孔中，以110-120V电压于TAE电泳缓冲液中电泳，待Marker和条带都跑开后，由凝胶成像仪观察并拍照，获得检测结果。